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专利名称:以细胞内连接为基础的定向基因重组技术的制作方法
技术领域:
本发明是生物技术领域的一种定向基因重组技术。
背景技术:
自上世纪70年代PCR技术和限制性内切酶发现以来,基因重组技术己经建立了一套完善的体系,其中主要主要包括目的基因的分离,目的基因和表达载体的切割,目的基因与表达载体的定向连接,宿主细胞的转化,阳性克隆的筛选等。目的基因和载体的连接有正向和反向两种方式,只有正向连接的基因才能够得到正确的表达,因此建立在双酶切基础上的定向连接是传统重组技术的核心。
目的基因和载体的切割和连接是其中操作作为最为繁琐,工作周期最长,并且失败几率最高的步骤。目前国内外很多生物技术公司陆续都开发出了用于简化操,作的试剂盒产品,比如凝胶回收试剂盒,PCR片段回收试剂盒,酶切片段回收试剂盒,快速连接试剂盒等,但仍然难以避免操作过程中基因片段的丢失。因此寻找更为简单的方法是必然的选择。
目前人们对定向重组技术的改造主要是通过以下两种方式实现的
1、模拟自然条件下生物基因重组的原理。比如Clontech公司以同源重组为基础的
In-fusion系统,Irwitrogen公司以位点特异性重组为基础的Gateway系统等,FA斯图尔特等申请的专利技术一一应用同源重组克隆和亚克隆的方法和组合物()等。自然重组技术不需要用户对目的基因进行切割和连接,只要将载体、目的基因和重组体系混合在一起处理适当的时间即可转化宿主细胞。自然重组技术需要载体末端和目的基因末端之间存在2040bp同源序歹ij,需要特殊的重组酶系,从而使基因重组的操作成本提高了50100倍。而且同源重组是一个动态的过程,重组成功率一般不会太高,并不适合在普通实验室推广使用。
2、以体内连接方式实现定向重组。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基础上建立的的USERFriendly系统等。常规的体内连接方式一般需要目的基因和载体之间具有912bp的互补序列,上述方法就是通过不同的方式在载体和目的基因之间建立这样一个互补序列。前者需要合成特殊的引物,而且需要特定的工具酶,成本是传统技术的1020倍;常规体内连接技术中互补配对载体必须具备一段很长的游离单链序列,在反复冻溶过程中很容易出现碱基脱落,影响连接效率,不适合长期储备或者工业化生产。
上述技术分别从不同的角度改良了重组技术,但是受到技术本身的缺陷所导致的成本过高或者连接效率过低等因素的影响,上述技术并不能替代既往传统的重组技术进行常规应用。
本发明对体内连接技术进行了改进,但是在特定载体构建过程中载体为原始载体或者平滑末端载体,重组载体容易保存,可经受反复冻溶,全过程在一个工作日内即可完成。
发明内容
本发明涉及生物技术领域一种新的定向基因重组操作技术,由重组载体,目的基因、定向配对复合物和宿主细胞构成;重组载体和目的基因两端含有212bp的同源序列,利用T4DNA聚合酶在特定底物缺失时产生的选择性核酸外切酶活性消化目的基因和载体,产生互补序列并互补配对。配对产物直接转入宿主细胞,通过宿主细胞内部的相关酶系进行连接。该技术对基因内部序列没有要求。
实施方式
1、制备定向重组载体
1)重组载体可以选用但不限于质粒、噬菌体或者病毒载体
2)在重组载体重组载体中引入两个定向同源序列;定向同源序列由任意两种或者三种碱基构成的碱基序列构成,优选但不限于由G、C或者G、C加上另外一种碱基构成定向同源序列,长度2到12bp,优选4到8bp;两个定向同源序列之间含有限制性内切酶酶切位;酶切位点两侧序列不同而且不能互补,定向同源序列总长度可选择但不限于212bp。
3)对载体中引入的酶切位点进行酶切处理
4)对载体进行或者不脱末端修饰处理,.修饰方式优选但不限于末端脱磷酸化修饰。
2、制备目的基因
1)合成分别具有载体上下游定向同源序列同源部分的上下游扩增引物。
2)目的基因的扩增,按照常规方法扩增目的基因,优选但不限于PfuDNA聚合酶。
3)目的基因鉴定,通过常规琼脂糖电泳鉴定。
4)目的基因提纯,去除PCR体系中残余的dNTP和引物。
3、定向匹配
定向匹配体系由T4DNA聚合酶,dNTP,和反应缓冲液组成的定向匹配复合物。方案一
1)将由重组载体和目的基因按照数量比为6:11:6的比例混合,推荐但不限于按照l:
3的的比例混合。
2)加入适当的T4DNA聚合酶,同源序列中不含有相关碱基的一种或者两种dNTP,以及反应缓冲液,按照工具盒操作说明进行处理。
3)目的基因和重组载体高温变性一段时间,推荐但不限于按照T4DNA聚合酶灭活的方式变性处理。
4)目的基因和重组载体低温复性一段时间,复性温度10到40摄氏度,推荐但不限于室温,复兴时间10分钟到1小时,优选但不限于优选
20到30分钟。方案二
1)将重组载体和目的基因分别加入适当的T4DNA聚合酶,并分别加入同源序列中不含有相关碱基的一种dNTP,在适当的条件下反应一段时间。
2)经过上述步骤处理后的目的基因和重组载体按照数量比为6:11:6,推荐按照3:1
的的比例混合。
3)变性和复性方式同方案一
4、转化宿主细胞。
细胞转化方式可以采用但不限于电转化或者化学转化方式。
电转化方式如下前期常规电击操作,电击完成后迅速加入复苏培养基,1037摄氏度复苏1012分钟感受态细胞,优选室温复苏45分钟,常规方式筛选。
化学转化方式重组载体与感受态细胞混合,冰浴560分钟,优选30分钟,迅速加入复苏培养基1037摄氏度复苏1012分钟感受态细胞,优选室温复苏45分钟,常规方式克隆化筛选。
本发明是在原有重组技术基础上进行的操作方法改进,使用者一般无须改变原有的操作****惯,容易适应。操作歩骤简单,线性片段和定向重组酶系可商品化生产,用户通过基因扩增后一般可直接进行定向连接,无须其他操作。操作周期短,包含PCR过程在内,一般在一个工作日内可完成全部操作。
实施实例
下面我们将以几丁质酶基因作为目的基因,定向克隆进入PUC18载体为例对技术进行具体说明,实例内容并不构成对本发明要求权利的限制。实验过程中选用的工具酶和试剂盒具体操作步骤参见个公司相关说明。
已知一种几丁质酶的基因序列为ATGCGCAAATTTAATMA......AGCGCCGGCGTTCAATAA
1线性载体的制备
首先在pUC18质粒DNA的用BamHI和HindIII酶切位点之间引入下列序列引入序列TGCGC^CGGG,下划线部分为限制性内切酶Hael11的酶切位点引入后状态GGATCC—TGCGCggC权利要求
1本发明涉及生物技术领域一种新的定向基因重组操作技术,由重组载体,目的基因、定向配对复合物和宿主细胞构成;重组载体和目的基因经过定向配对复合物处理后按照碱基互补原则定向互补配对,配对产物直接转化宿主细胞,连接反应在细胞内进行。
(1)中所描述的定向基因重组技术,其特征是定向重组载体来源于质粒,粘粒,噬菌体或者病毒;定向重组载体还有重组位点,经过限制性内切酶切割后形成两个连接点序列,分别为连接序列A和连接序列B;连接序列是由A、T、C、G中任意两种或者任意三种碱基构成的212bp
的碱基序列。
(1)中所描述的定向基因重组技术,其特征是定向目的基因为PCR产物或者酶切后加工的产物;目的基因两侧末端含有212bp的连接序列a和连接序列b,分别与权力要求2所述载体连接序列与载体中连接序列A和连接序列B同源。
(1)中所描述的定向基因重组技术,其特征是:定向配对复合物由T4DNA聚合酶,dNTP中的一种或者两种,以及相应的反应缓冲液构成。
(1)中所描述的定向基因重组技术,其特征是宿主细胞来源于大肠杆菌、酵母细胞、昆虫、鼠和人;宿主细胞中含有DNA连接酶系。
(1)中所描述的定向基因重组技术,其特征是定向目的基因和定向重组载体经过定向配对复合物处理后,同源序列部分形成突出的单链结构,并且同源序列之间能够按照碱基配对原则互补配对,既重组载体连接连接序列A和目的基因连接序列a配对;重组载体连接序列B和目的基因连接序列b配对。
(1)中所描述的定向基因重组技术,其特征是定向目的基因和定向重组载体按照权力要求5所所描述的方式互补配对后,可直接转化宿主细胞;目的基因和重组载体的连接在宿主细胞内完成。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域一种新的基因重组技术。在目的基因两侧分别引入2~12个碱基的序列特征不同的配对序列,配对序列和载体两个连接点末端的配对序列分别同源。利用T4DNA聚合酶在特定底物缺失时产生的选择性核酸外切酶活性消化目的基因和载体,产生互补序列并互补配对。配对产物直接转入宿主细胞,通过宿主细胞内部的相关酶系进行连接。该技术具有周期短,费用低,操作简单,成功率高,对目的基因内部特征无要求等优点,适合实验室常规基因表达研究和大规模的基因表达操作。