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专利名称::从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法
技术领域:
:本发明涉及生物、医药及食品工业
技术领域:
,更具体涉及一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法。
背景技术:
:,生物技术中,溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶,国外多用于菌体内容物质的提取;在医药上,溶菌酶具有多种药理作用,广泛应用于临床医学,溶菌酶作为存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效;在食品工业中由于溶菌酶本身是天然蛋白质,无毒性,是安全性高的食品添加剂,可以作为防腐、保鲜剂,广泛应用于乳制品、低度酒、饮料、水产品、肉类制品和糕点等的防腐保鲜。如今,全国各地鸡蛋生产发展迅猛,鸡蛋的销量不断增加,蛋品的深加工成为大家日益关注的问题。因此,蛋清中溶菌酶提取的研究成为当今一大热门课题。,无臭、微甜,易溶于水和盐溶液,不溶于***、***,遇碱易被破坏。溶菌酶对革兰氏阳性菌(如溶壁小球菌、黄色八叠球菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌)有溶菌作用,一般对革兰氏阴性菌无效。实验证明,溶菌酶可催化某些细菌细胞壁多糖的水解,从而溶解细菌的细胞壁。底物与酶结合后,溶菌酶专一性地作用于
NAM-NAG键。细胞壁肽聚糖支架被破坏,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解。因此,溶菌酶能选择性地分解微生物的细胞壁,同时不破坏其他组织,对人体细胞不会产生降解作用,不但安全性很高,而且具有一定的保健作用。3溶菌酶及其研究进展溶菌酶(7j^^^e)是由弗莱明在(1922)年发现的有效的抗菌剂,全称为l-4-f3-N-溶菌酶,又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶,分子量为14000-15000,等电点11左右。蛋清中溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球蛋白,它能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖***和N-乙酰胞壁酸之间的e-1-4,糖苷键,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解。目前,国外已经生产出活性达50000U/mg的溶菌酶,而国内生产溶菌酶的酶活性较低,大多只有18000U/mg左右,纯度也不高。本课题研究了提取高活性溶菌酶的方法及大规模生产的工艺参数,可以工业化生产出活性大于等于40000U/mg的溶菌酶。溶菌酶的提取主要有以下的几种方法直接结品法溶菌酶是一种盐溶性蛋白质,而蛋清中其他蛋白质的等电点都为酸性条件,利用这一特点,在蛋清中加入一定量的***化物、碘化物或碳酸盐等盐类,-,降低温度,溶菌酶会以结晶形式慢慢析出,而大多数蛋白质仍然存留在溶液中。在超滤浓縮脱盐后,
为获得较纯产品,采用结晶纯化歩骤,酶液经超滤处理后,,离心去除杂质,上清液在缓缓搅拌下,加***化钠至5%,静置一周,得粗结晶。,分去不溶物后,进行重结晶,二次结晶的最终得率为60%左右。活力测定为8000U/mg。直接结晶法生产周期长,收率低,纯度和活性低,不适合工业化生产。聚丙烯酸沉淀法聚丙烯酸沉淀法首先经过吸附步骤,即将鸡蛋清用20%的***,在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出,然后加入15%聚丙烯酸,立即有白色沉淀析出,,静置17个小时进行倾析,得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离,将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。,将其溶解,转移后,。加入5%***化钙溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离,至无沉淀析出,然后过滤,得到澄清溶液。第三步盐析,'C。待有晶体析出后,用无水乙醇洗涤数次,置恒温培养箱中4CTC条件下干燥称重。聚丙烯酸沉淀法生产周期较长,提取过程中使用的试剂存在不安全因素,产品不适用于食品医药等行业。超滤法超滤是一种以压力为动力,利用超滤膜不同孔径对液体进行分离的物理筛分过程。蛋清溶菌酶是小分子物质,并且与蛋清中其他相对分子质量高的蛋白质存在着静电作用力,以结合态存在,采用不同的前处理工艺,降低溶菌酶与其他蛋清蛋白之间的作用力,使溶菌酶处于解离状态后,采用超滤的方法对蛋清溶菌酶进行分离提取。张灏等人通过试验初步确立了蛋清溶菌酶的超滤工艺即料液的
,采用截留相对分子质量为3万的PES膜,连续方式稀释3倍进行超滤;透过液用截留相对分子质量为3000的PES膜进行浓縮,冷冻千燥后得到蛋清溶菌酶样品,酶活力为每毫克蛋白质14610U或16831U,经电泳检测酶的纯度较高。超滤法操作简单,提取过程无有害物质引入,适合工业化生产,但提取方法比较粗放,产品质量较差。离子交换树脂法离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分离的,分离的效果较好,广泛用于微量组分的富集。一般流程为鲜蛋-预处理-搅拌吸附-上柱洗脱-等电点沉淀-透析-喷雾干燥-成品。蛋清将调至pH-(卵粘蛋白等电点,于沸水浴迅速升温至75°C,维持5min,流水冷却至室温,,静置5-6h,过滤或离心除去沉淀,再将pH调至中性。724树脂经浸泡处理去杂质,以2mol/L氢氧化钠转型为^+型阳离子树脂,1/15(mol/L)磷酸缓冲液()平衡过夜。动态交换法洗脱,先将处理转型后的树脂装柱,,再用3倍体积1/15(mol/L)磷酸缓冲液(p
)洗涤树脂柱,除去未吸附杂质,以质量浓度为10%的硫酸铵溶液洗脱,洗脱液经核酸蛋白检测仪(入^80nm)检测,部分收集器收集含溶菌酶的洗脱液。树脂则5进行充分清洗转型后备用。含酶洗脱液经截留分子量为5000Da的聚砜膜超滤浓縮脱盐,冷冻干燥得成品。亦可加终浓度至5X的NaCl,4'C静置24h得结晶。离子交换树脂法比较先进,但是提取过程中引入了硫酸铵,产品不适用于食品医药行业。亲和层析法亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性,即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。酶-底物复合物形成之后,在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。常常使用的吸附剂为几丁质及其衍生物,如几丁质粉、羧***几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶。王炜军等人探讨了磁性亲和分离方法,磁性介质己被广泛用于分离细胞及核酸、蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质。其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其他固形物杂质间的分离,尤其是当待分离的液体样品含有固形物或较为粘稠时更显现其优越性。蛋清粘度较大,,即在原有亲和层析介质的基础上引入具磁响应性的四氧化三铁颗粒,使得介质复合了特异亲和吸附和磁响应性的功能,
但使用这种方法时,随着四氧化三铁颗粒的引入同时又导致了介质对杂蛋白的非特异吸附。为克服这种非特异吸附,,取得了较好的效果,但这种吸附最终也导致了部分活力回收的丧失。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法。该方法利用溶菌酶有带电荷基团的特点,使用D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂提取,再用高浓度钠离子洗脱,工艺简单易行,操作方便,提取液的超滤除盐技术也已成熟。而且应用此法提取溶菌酶的活性较高,纯度也很高。此外,鸡蛋清来源广泛,提取后的鸡蛋清不改变性状,还可以再回收加工,提取成本低廉。为了实现上述目的,本发明采用以下技术措施一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法,其歩骤是--25'C,往30公斤的蛋清中加入30升的软化水(俗称去离子水),-。-25t:,压力8-llMPa条件下,进行均质。,用2mol/L的***化氢溶液调pH值到4-。%的氢氧化钠溶液,D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与氢氧化钠溶液的以体积比1:2混合,在搅拌罐里搅拌2—,,D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂才活化好。
D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与蛋清以体积比例1:6混合,在搅拌罐内搅拌吸附30—90分钟。,滤干。用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的杂蛋白,直到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中溶液的TDS(可溶性固形物含量)为300-500mg/L,D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂方洗干净,去掉溶菌酶的蛋清(回收)。***化钠溶液与清洗干净的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂以以比体积比5:1混合,在搅拌罐中搅拌,洗脱吸附到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的溶菌酶,洗脱时间为120—150分钟。,滤干。用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的残留溶菌酶2-3次。—28。C,进膜压力6—8bar时超滤,浓縮,除盐。其间不断加水,%(质量比);。干燥塔进口温度120—160。C;出口温度50—75。C。,价格低廉;、浓縮工艺简单易行,技术成熟;,确保了产品质量的安全性。,保持了原有品质,使其能够完全回收,再进行其它深加工。、医学技术及食品工业等领域都有广泛的应用,具有重要的科学价值和经济效益;
,因此它的安全性是非常高的。,在产品有较高活性和纯度的基础上保证了高产量。图1为一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的方框示意图图2为一种溶菌酶纯度检测电泳图。具体实施例方式一、一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法,。C下,往30公斤的蛋清1中加入30升的软化水(俗称去离子水),。'C,压力8或9或10或llMPa条件下,进行均质3。,用2mol/L的***。:用质量浓度为4或5或6%的氢氧化钠溶液,D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与氢氧化钠溶液以体积比1:2混合,在搅拌罐里搅拌120或130或135或140或142或145或150分钟后,用软化水洗7至流出液pH值=,D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂才活化好。:6混合,在搅拌罐内搅拌吸附6,搅拌吸附30或35或45或50或60或70或80
或90分钟。,滤干。用软化水清洗7D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的杂蛋白,直到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中溶液的TDS(可溶性固形物含量)为300-500mg/L,D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂方洗干净,去掉溶菌酶的蛋清13(回收)***化钠溶液与清洗干净的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂以比体积比5:l混合,在搅拌罐中搅拌,洗脱8吸附到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的溶菌酶,洗脱8时间为120或130或140或150分钟。,滤千。用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的残留9溶菌酶2-3次。上述步骤4、5、6、7、8中所述用的树脂还有D151大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂和D113大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂。。C,进膜压力6或7或8或9或10bar时超滤10,浓縮,除盐。其间不断加水,%(质量比);。进口温度120或125或135或137或139或141或143或145或151或155或160°C;出口温度50或55或60或61或62或63或64或65或70或75°C6。a:树脂对蛋清饱和吸附时间的测定吸附从10分钟开始取样,每次间隔10分钟至60分钟,取出的样用传统方法进行检测。
tableseeoriginaldocumentpage10(注,Omin均质过的蛋清,样品活性在132000U/ml,10min到60min的样没稀释,)b:Nacl溶液对吸附后树脂饱和洗脱的测定洗脱从30分钟开始取样,每次间隔10分钟至90分钟,样液稀释1000倍检测。tableseeoriginaldocumentpage10('沐:以l:)二、溶菌酶活性及纯度的测定--(1)检测原理溶菌酶是能切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖***间的B-l,4糖苷键的水解酶,微球菌(革兰氏阳性)的细胞壁结构组织主要含有以上成分,所以溶菌酶能破坏微球菌的细胞壁,使细菌在渗透压差的作用下破裂而被溶解,降低菌液的吸光度值。根据国际酶活力单位定义,在25'C,酶反应最适条件下,(U)。(2)实验试剂与器材-实验样品溶菌酶(湖北神地农业科贸有限公司溶菌酶中试基地生产),微球菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供,均能购买)。试剂无菌生理盐水,营养琼脂培养基,营养肉汤培养基。磷酸盐缓冲液(***,加入溶解成1000ml,)器材超净工作台,水浴振荡培养箱,高压灭菌锅,高速离心机,紫外可见分光光度计,水浴锅等。(3)实验内容供试品溶液的制备取样品约250mg用磷酸盐缓冲液溶解,置100ml量瓶中,加磷酸盐缓冲液适量定容,再用磷酸盐缓冲液稀释