文档介绍：该【人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【32】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的制作方法
专利名称:人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的制作方法
技术领域:
本发明涉及使用源自M13噬菌体的PlX的工程化杂交噬菌体载体来生成Pix噬菌体展示文库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。
背景技术:
噬菌体展示是基于亲和力的多肽选择的一种成熟工具。在典型的噬菌体展示选择中,将多肽文库经基因工程融合至丝状噬菌体M13外壳蛋白其中之一的末端。噬菌体颗粒提供所述文库的每个多肽成员与其编码基因之间的物理关联。接着可针对与所需靶分子结合的文库成员,对噬菌体文库进行亲和选择即淘选。将文库与靶分子混合,洗掉未结合的噬菌体颗粒,洗脱剩下的噬菌体并通过在大肠杆菌细胞中培养而扩增。尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示,然而pill和pVIII仍是目前最常用的融合伙伴。pill是42kD的次要外壳蛋白,其负责噬菌体感染进入大肠杆菌。每个噬菌体颗粒在其表面含有最多五个拷贝的pill蛋白,聚集在噬菌体的一端。PVIII是噬菌体的主要外壳蛋白;数千个拷贝的PVIII(分子量为5kD)在单链病毒基因组周围以有序的方式排列而构成噬菌体衣壳。除了ΡΙΠ,Μ13还有三种其他次要外壳蛋白PVI(12kD的蛋白)以及PVII和
pIX,其中pVII和pIX是涉及装配起始和稳定性维持的短蛋白质(分别具有33和32个氨基酸)。五个拷贝的pVI蛋白位于噬菌体的与pill相同的一端,而五个拷贝的PVII和pIX的每一者均位于噬菌体的相对两端。虽然已证实在许多情况下可产生与pill和pVIII融合的噬菌体文库展示融合物,但由噬菌体展示的多肽却受到某些生物学约束。例如,大多数长度为八个或更多个氨基酸的肽不能很好地展示为与pVIII的融合物。此外,与噬菌体蛋白自身相互作用或以其他方式影响PlII或pVIII的表达、整合或活性的多肽将在文库中递呈效率低,因为展示它们的噬菌体生长不良。最后,因为PlII是相当大的蛋白,PlII展示的多肽通往某些靶位点的通路(例如,蛋白表面的深而窄的缝隙)或以多聚体形式时发挥最佳功能的多肽的正确装配可能会将在空间上受到阻碍。因此,根据利用其他外壳蛋白(其具有不同结构和生物学功能,因此可预计会对所展示的多肽施加不同的约束)的噬菌体文库选择将有助于确保搜寻最大量的序列多样性。在概念验证实验中,已证实PVII和PlX可用于展示抗体片段和肽。这些结果是特别值得注意的,因为早期研究表明将多肽融合至PVII和pIX的N末端使得这些外壳蛋白失去功能。可通过使用噬菌体、噬菌粒或杂交载体实现在噬菌体上展示外源多肽。通过使用噬菌体载体,所关注的基因可被引入噬菌体基因组中作为与天然外壳蛋白基因的框内融合物。这些载体作为全功能噬菌体独立地繁殖并展示多拷贝的外源多肽。相反,噬菌粒载体
是除细菌复制起点之外还含有噬菌体复制起点和包装信号的质粒。噬菌粒携带融合到外壳蛋白基因的重组拷贝中的所关注的基因,并且一旦用辅助噬菌体救援,噬菌粒即被包装进子代病毒中,其中展示的多肽整合在噬菌体外壳中。对辅助噬菌体的需要导致噬菌粒载体比噬菌体载体劳动强度更大,并且使定量任何指定样品中所存在噬菌体数量的工作复杂
3化。此外,由于噬菌体颗粒可同时利用野生型外壳蛋白和融合外壳蛋白进行装配,因此所得噬菌体的某些部分将不展示所关注的多肽序列,从而导致较低的展示效率。杂交载体类似于噬菌体载体,因为噬菌体基因组中携带有融合蛋白并且不需要辅助噬菌体,杂交载体还类似于噬菌粒系统,因为基因组也携带有融合蛋白的野生型拷贝。关于PlX噬菌体展示的先前报道描述了在噬菌粒载体环境中的融合;关于在来自杂交载体或噬菌体载体的PlX上展示多肽尚未见报道。最近已报道了多肽在来自噬菌体载体的PVII上的展示。需要提供合成的非抗体肽或蛋白质文库,和同时提供人治疗性肽和蛋白质的高亲和力和活性、高产率、良好的溶解性质以及在人中施用时低免疫反应倾向这些关键要素的方法。相对于现有的方法,还需要提高从合成文库中分离非抗体肽或蛋白质的效率,以减少发现非抗体肽或蛋白质的资源耗费以及加速提供非抗体肽或蛋白质用于生物学评价。通过
将综合设计、装配技术以及噬菌体Pix肽或蛋白质展示加以结合,本发明的文库和方法满足了这些需求。
发明内容
本发明提供可与PVII和PlX噬菌体展示一起使用的工程化Pix噬菌体载体,用于利用M13噬菌体的PlX生成肽或蛋白质文库,如使用诱变或其他多样性产生技术,可选地使用同步成熟(inlinematuration),从而为肽或蛋白质及非抗体肽或蛋白质片段的生成以及治疗性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明,提供了杂交噬菌体载体,其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组PlX编码区。本发明提供将肽和蛋白质展示为与pIX或pVII噬菌体蛋白的融合物的噬菌体载体,以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库,所述文库用于例如(但不限于)筛选、选择、工程改造、成熟或其他用途,例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。因为天然基因IX的调控区和编码区与PVII和pVIII的调控区和编码区重叠,简单融合至该基因的末端可能造成噬菌体失活(Hill和Petersen,=32-46,1982)。本发明的载体包括该融合体而同时保留天然外壳蛋白的调控区。该载体(而不是噬菌粒)的使用不需要辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养噬菌体所花费的时间和工作量。此外,
这些展示系统的多价特性使得它更容易检测低亲和力结合物。因此本发明提供了新型载体构建体,其用于以PlX噬菌体展示形式表达肽或蛋白质,以构建多肽阵列。具体地讲,本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组PlX编码序列的工程化PlX噬菌体载体,其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体PVII或PlX蛋白的氨基末端的外源多肽。优选地,所述噬菌体颗粒在其表面包含表达的融合蛋白。在一方面,本发明提供了工程化的重组核酸噬菌体载体,其用于表达结合至所选生物活性配体上的噬菌体展示融合肽或蛋白质,该载体包含(a)编码重组噬菌体前导序列的核酸序列;可操作地连接至(b)重组标签、启动子或选择编码核酸序列;可操作地连接至(c)重组PlX或PVII编码核酸序列;可操作地连接至(d)重组限制位点;可操作地连接至(e)编码肽接头的核酸序列;可操作地连接至(f)选择性地结合至生物活性配体上的第一外源肽或蛋白质编码序列;(g)pVII编码核酸序列;(h)编码天然pIX的核酸序列;(i)pIII编码核酸序列;以及(j)pVI编码核酸序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述噬菌体前导编码序列为pelB序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列为FLAG标签序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列选自SEQIDN0:3、4、5或6。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述FLAG标签序列包含SEQIDNO:2
。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述启动子为诱导型启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述诱导型启动子为Iac启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述肽接头选自SEQIDN0:7和8。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述第一外源肽或蛋白质是推定的生物活性蛋白质或肽。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述生物活性配体介导至少一种生物体内活性。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述载体编码融合至至少一种噬菌体外壳蛋白上的第二外源肽或蛋白质。本发明还包括包含工程化的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞。该宿主细胞可表达生物活性融合蛋白。本发明还涉及由根据本发明的细菌宿主细胞表达的生物活性融合蛋白。本发明还涉及源自所述融合蛋白的生物活性外源肽或蛋白质。本发明还涉及包含复数种根据本发明的工程化核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞的噬菌体文库。所述噬菌体文库可包括其中所述第一外源肽或蛋白质的变体被表达。本发明还提供针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文库进行筛选的方法,所述方法包括(a)由噬菌体文库表达外源肽或蛋白质,以及(b)选择表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。本发明还提供根据此方法获得的外源肽或蛋白质编码核酸。在一个实施例中,噬菌体载体还编码第二融合多肽,其中所述第二融合多肽包含
融合至PlX或PVII蛋白的氨基末端的第二外源多肽,并且第一融合多肽中的第一外源多肽融合至PlX或PVII蛋白的氨基末端。在一个实施例中,第一和第二融合多肽可联合形成异型二聚体蛋白质复合物,例如靶标蛋白质、受体、核酸结合蛋白或酶。在另一个实施例中,本发明描述了用于在丝状噬菌体表面表达融合蛋白的载体,所述载体具有用于表达所述融合蛋白的表达盒。该表达盒包含上游和下游可翻译DNA序列,该DNA序列通过适于插入DNA定向连接的核苷酸序列(即多位点接头)可操作地连接,其中上游序列编码原核分泌信号,下游序列编码PVII或pIX丝状噬菌体蛋白。该可翻译DNA序列可操作地连接至一组DNA表达信号上,以将该可翻译DNA序列表达为融合多肽的一些部分。在一个优选变型中,该载体任选还包含第二表达盒,用于在丝状噬菌体表面上表达第二融合蛋白,其中该第二表达盒具有第一表达盒的结构,前提条件是第一融合蛋白表达盒编码pIX或pVII蛋白和/或第二融合蛋白表达盒编码pIX或pVII蛋白。该载体被用作噬菌体基因组来在噬菌体颗粒表面上表达异型二聚体蛋白质复合物,其中该异型二聚体的两种外源多肽通过融合至第一和第二噬菌体蛋白(pVII和/或pIX)而锚定在噬菌体颗粒上。在另一个实施例中,基于所述工程化的pIX噬菌体载体,本发明设想了根据本发明的噬菌体颗粒文库(即组合文库),其中该文库中的代表性颗粒各自展示不同的融合蛋
白。在颗粒展示异型二聚体蛋白质复合物时,该文库包含异型二聚体的组合文库,例如Fv分子文库形式的非抗体肽或蛋白质。优选的文库具有至少103、104、105、106、107、108、109、101(1、1011、1012、IO13(或其中任何范围或数值)种融合肽或蛋白的组合多样性。一个相关的实施例描述了包含由本发明的工程化PlX噬菌体载体表达的第一和第二多肽的融合蛋白,其中第一多肽是外源蛋白而第二多肽是丝状噬菌体PVII或pIX蛋白,其中外源蛋白融合至丝状噬菌体蛋白的氨基末端上。另外,本发明还设想了多种从本发明的工程化pIX噬菌体载体表达蛋白质或肽的方法,用于产生噬菌体的组合文库,包括将编码外源多肽的全套基因克隆到本发明的载体中、通过诱变来修饰文库中外源多肽的结构、随机组合第一和第二融合蛋白文库的群体、通过靶向及亲和筛选(“淘选”)来改变文库的多样性等等。设计具有改进的或新颖的功能的蛋白质是一个具有多种医学、工业、环境以及基础研究应用的重要目标。在用工程化PlX噬菌体载体开发非抗体肽或蛋白质组合文库后,强有力的下一步骤是朝着人造非抗体肽或蛋白质构建体以及其他蛋白质基序推进,所述人造抗体构建体以及其他蛋白质基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。本发明通过将工程化的pIX噬菌体载体用于构建多肽组合阵列而提供噬菌体展示形式来应对这些挑战,所述多肽组合阵列中pVII和/