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专利名称:亚硫酸氢盐处理的改进方法
技术领域:
本申请涉及一种通过亚硫酸氢盐反应来确定核酸即***化或非***化的胞嘧啶中***化位点的方法,其中在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中,核酸被与固相结合。固相优选地为含有玻璃或硅石的材料,更优选的是玻璃棉(glassfleece)、玻璃膜或者磁性玻璃颗粒。更进一步地,公开了固相在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中用于结合核酸的用途,以及一种含有亚硫酸氢盐试剂和固相的试剂盒。
背景技术:
基因仅构成了全部哺乳动物基因组的一小部分,且在非编码脱氧核糖核酸(DNA)的大量存在下其表达的精确调控对它们的调控而言表现为一个重要的问题。非编码的DNA,包括内含子、重复元件以及潜在的活性可易位的元件需要有效的机制来使之长期的沉默。为了有助于这种沉默,哺乳动物通过胞嘧啶***化给予的可能性来提供一种可遗传的改变DNA-蛋白间相互作用的机制。DNA的***化是哺乳动物发育所必需的,且在老化和癌变中发挥潜在的作用。***化在基因表达中的涉入以及作为后生修饰标记基因已被完全的确定。在哺乳动物中,***化仅发生在胞嘧啶残基上,而且更特定的仅发生在与鸟嘌呤相邻的胞嘧啶上,即
CG序列。DNA***化位点的检测和图谱定位是了解显示给出的序列是否是***化的分子信号的必要步骤。
目前,FormmerM,等,ProcNatlAcadSciUSA89(1992)1827-31描述的通过所谓亚硫酸氢盐法检测5-***-胞嘧啶已被完成。对5-***胞嘧啶作图的亚硫酸氢盐方法是利用亚硫酸氢钠和胞嘧啶的反应的作用,而不与或者仅仅是较少的与5-***-胞嘧啶反应。胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应产生磺化的胞嘧啶反应中间体,它易于去氨基而产生磺化的尿嘧啶,后者在碱性条件下能被去磺化而生成尿嘧啶。众所周知,尿嘧啶具有胸腺嘧啶的碱基配对行为,有别于胞嘧啶的离析物,而5-***胞嘧啶具有胞嘧啶的碱基配对行为。这就可能通过例如亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg,,S,Bioessays16(1994)431-6;Grigg,G..W,DNASeq6(1996)189-98)或者US5786146公开的***化特异性PCR(MSP)区别***化或非***化的胞嘧啶。
各种不同的文献描述了关于亚硫酸氢盐反应的特殊方面(Benyajati,C,等,NucleicAcidsRes8(1980)5649-67),它们总体上研究了亚硫酸氢盐修饰5-***-脱氧胞嘧啶和脱氧胞嘧啶(Olek,A,等,NucleicAcidsRes24(1996)5064-6),公开了一种用于亚硫酸氢盐碱基测序的方法,由此在琼脂糖珠包埋的材料上进行亚硫酸氢盐处理和后续的PCR步骤。如
Clark,,等,NucleicAcidsRes22(1994)2990-7公开的方法中,样品在去氨基后脱盐。
Raizis,,等,在AnalBiochem226(1995)161-6公开了模板降解最小化的5-***胞嘧啶图谱定位的亚硫酸氢盐方法。他们研究了pH、温度和反应时间的影响。Grunau,C,等,NucleicAcidsRes29(2001)E65-5或Wamecke,,等,Methods27(2002)101-7也做了同样的研究。WO01/98528或Paulin,R,等,NucleicAcidsRes26(1998)5009-10中公开了在亚硫酸氢盐混合物中的其它不同的成分。WO02/31186公开了在亚硫酸氢盐处理和PCR后的其它亚硫酸氢盐步骤。Komiyama,,S,TetrahedronLetters35(1994)8185-8188研究了亚硫酸氢盐诱导的在寡聚脱氧核苷酸中的胞嘧啶的去氨基的催化作用。
用于进行亚硫酸氢盐处理的试剂盒是可从Intergen商业获得的,由SerologicalsCorporation,Norcross,GA,USA,提供,例如CpGenomeTMDNA修饰试剂盒。
Feil,R,等,NucleicAcidsRes22(1994)695-6公开了亚硫酸氢盐基因组测序的变换方法,其中基因组DNA在去氨基后是结合在玻璃珠上的,然后洗涤。洗脱后核酸再去磺化。已知核酸能够利用其与玻璃表面的结合特性,例如被硅胶或硅藻土吸收,在离液序列高的条件下被磁性玻璃颗粒(MGPs)或有机硅烷颗粒吸收而被分离。利用固相的提取通常包含步骤在允许目的物质与固相结合的条件下,将核酸溶液加到固相上,从结合固相的核酸上除去残液以及随后将核酸从固相上释放到洗出液中
(有时称作洗脱)。这些方法的产物通常是含有溶解状态的目的物的溶液。
所有现有技术的亚硫酸氢盐处理的方法都有缺陷。因此,本申请解决的问题是提供一种克服现有技术方法缺陷的方法。
发明内容
上述讨论的问题的解决是通过提供一种用于将核酸中的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的方法而解决的,优选的是将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基,由此优选的是5-***-胞嘧啶不会显著转化(“亚硫酸氢盐反应”或“亚硫酸氢盐处理”),在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中,核酸是与固相结合的。优选的,该固相是玻璃棉,玻璃膜或者磁性玻璃颗粒。本发明进一步地公开了亚硫酸氢盐反应中去氨基和/或去磺化步骤中固相的用途,以及含有固相和用于进行亚硫酸氢盐反应的试剂的试剂盒。
固相在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中,优选在去磺化步骤中的应用,具有操作简单和/或易于自动控制的优点。例如,在去氨基和/和去磺化步骤中使用玻璃棉时,不需要进行耗时的DNA沉淀反应;通过离心可易于实现无结合分离,玻璃棉损失的体积可以忽略不计,因此洗涤步骤就非常有效。当亚硫酸氢盐处理的DNA用于潜在的抑制因子可显著地降低灵敏度的
PCR时,这是一个优点。本发明所述的方法易于手工操作,而且适用于没有常规分析仪器的较小的实验室。对于具有较大流通量的实验室,可通过常规分析仪器处理的固相特别是磁性玻璃颗粒的使用是非常有利的。在常规的亚硫酸氢盐反应中,采用变性条件,因为亚硫酸氢盐仅和不会参与碱基配对的嘧啶反应。由于核酸通过不同的相互作用与固相表面结合,这种结合可能影响亚硫酸氢盐反应的成功,因此出人意料的,本发明的方法可以使亚硫酸氢盐反应成功而且到达令人满意的程度。
根据本发明,术语“亚硫酸氢盐反应”,“亚硫酸氢盐处理”或“亚硫酸氢盐方法”应该是指在核酸中的一个胞嘧啶碱基特别是多个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基或者多个胞嘧啶碱基的反应,优选的在亚硫酸氢盐离子存在的条件下,由此5-***-胞嘧啶优选不被显著的转化。Frommer等,同上以及Grigg和Clark,同上详细描述了***化胞嘧啶的检测反应。亚硫酸氢盐反应包括一个去氨基步骤和一个去磺化步骤,这两步可以分开或同时操作(见附
图1;Grigg和Clark,同上)。所述5-***-胞嘧啶没有被显著的转化应当仅是考虑到不排除小比例的5-***-胞嘧啶转化为尿嘧啶,尽管这仅仅意欲转化为(非-***化)的胞嘧啶碱基(Frommer等,同上)。
本发明的方法能够在几种亚硫酸氢盐反应排列和固定步骤中进行。在第一个实施方案中,当核酸与固相结合时,进行去氨基和去磺化步骤。因此在本发明优选的实施
方案中,公开了将核酸中的一个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基,优选的是将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基(“亚硫酸氢盐反应”),由此5-***-胞嘧啶碱基优选没有被显著的转化的方法,包括步骤a)将核酸与固相结合,b)在亚硫酸盐离子存在的条件下,温育固相结合的核酸,从而使核酸去氨基,c)可选择地洗涤去氨基的固相结合的核酸,d)在碱性条件下,温育去氨基的固相结合的核酸,从而使去氨基的核酸去磺化,e)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸,和f)可选择地将去氨基和去磺化的核酸从固相上洗脱下来。
本发明的第二个实施方案中,当核酸与固相结合时去磺化。因此,本发明的另一个优选实施方案公开了一种将核酸中的一个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基,优选地将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基,由此5-***-胞嘧啶碱基优选没有被显著的转化(“亚硫酸氢盐反应”)的方法,包括步骤a)在亚硫酸盐离子存在的条件下,温育核酸使核酸去氨基,b)将去氨基的核酸与固相结合,c)可选择地洗涤去氨基的固相结合的核酸,d)在碱性条件下,温育去氨基的固相结合的核酸,从而使去氨基的核酸去磺化,e)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸,和f)可选择地将去氨基和去磺化的核酸从固相上洗脱下来。
在本发明的第三个实施方案中,当核酸与固相结合时去氨基。因此,在本发明另一个优选的实施方案中,公开了一种将核酸中的一个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基,优选地将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基,由此5-***-胞嘧啶碱基优选没有被显著的转化(“亚硫酸氢盐反应”)的方法,包括步骤a)将核酸与固相结合,b)在亚硫酸盐离子存在的条件下,温育固相结合的核酸,从而使核酸去氨基,
c)可选择地洗涤固相结合的核酸,d)将去氨基的核酸从固相上洗脱下来,e)在碱性条件下温育去氨基的核酸,从而使去氨基的核酸去磺化。
本领域熟练的技术人员可通过参考例如Frommer等,同上,或Grigg和Clark,同上,公开的亚硫酸氢盐反应的主要参数知道如何进行亚硫酸氢盐反应。本领域的技术人员从Grunau等,同上文的文献中可知亚硫酸氢盐反应的何种改变是可能的。温育时间和温度对去氨基效率的影响,以及影响DNA降解的参数都是公开的。总而言之,在去氨基步骤中,含有亚硫酸氢盐离子的缓冲液,使用了可选择的离液剂和可选择的其它试剂例如乙醇或者稳定剂例如氢醌,而且pH在酸性范围内。,,离液剂的浓度是1到8M,优选地使用胍盐,pH是在酸性范围,,温度是0℃到90℃,优选地是在室温
(25℃)到90℃,而且反应时间是30分钟到24小时或48小时或更长,但是优选地是1小时到24小时。去磺化步骤是通过添加碱性溶液或缓冲剂,例如仅含氢氧化物,如氢氧化钠的溶液,或者是含有乙醇,***化钠和氢氧化钠的溶液(例如38%EtOH,100mMNaCl,200mMNaOH)来进行的,而且是在室温或者稍高一些的温度温育几分钟,优选地是5到60分钟。
在本发明的一个实施方案中,核酸是脱氧核糖核酸(DNA),特别是基因组DNA或者核酸,即DNA或者已在生物体基因组中发现的且作为生存必需的信息传递给后代的核酸。这些用语是用来区别其它类型的DNA,比如质粒中发现的DNA。核酸的来源可以是真核生物或者原核生物,优选地是脊椎动物,特别是来自哺乳动物,最优选的是来自动物或者人类。
在本发明的一个实施方案中,核酸被结合到未修饰的固相上,即核酸直接与固相结合,而没有任何介导与固相结合的化合物。核酸结合到固相的未修饰的表面,由此与表面的结合也应该考虑到固相可能含有的孔道以及核酸可能在固相的孔道中与其表面结合。根据本发明的实施方案,固相可以是一种离子交换剂(可商业获得的,例如来自AmershamBiosciencesEurope,Freiburg,Germany),在特殊条件下它能与核酸结合,羟磷灰石(可商业获得的,来自Sigma,Taufkirchen,Germany),玻璃或硅石,或者含有玻璃或硅石的材料,优选地具有未修饰的表面。在另一个实施方案中,固相可以是已修饰的,即固相通过介导与固相结合的化合物与核酸间接结合,比如利用核酸与已连接到表面的寡聚核苷酸的序列特异性结合,或者是链亲和
素(已结合到固相表面)与已生物素标记的DNA结合。适用的颗粒是可商业获得的,来自DYNAL,Oslo,Norway以及在WO90/06045中描述过的。
术语“未修饰的”应该是指没有更进一步的化学修饰,即没有其它的化学基团共价或非共价地连接。术语“未修饰的表面”,“未修饰的硅石表面”或“未修饰的玻璃表面”应该是指没有其它的化学基团共价或非共价地结合,这些化学基团用作核酸结合的中间物质,而且核酸与中间物质而非硅石表面本身结合。因此,核酸优选地通过氢键和其它的原子力直接地与“未修饰的表面”结合。一个修饰的表面的例子是硅石表面,以序列特异性方式结合核酸分子的寡核苷酸的连接在上面。另一个修饰的硅石表面的例子是以链亲和素包被的硅石表面,链亲和素与已生物素化的DNA分子结合。
在本发明的一个特别优选的实施方案中,固相是含有玻璃或硅石的材料,优选具有未修饰(玻璃或硅石)表面,例如玻璃纤维或,硅藻土,玻璃珠或颗粒,玻璃膜或磁性玻璃颗粒或其它的覆有未修饰玻璃面的物质。特别优选的是玻璃羊毛或玻璃膜或磁性玻璃颗粒。这些固相被公开在EP0389063或US5234809中。
DNA或核酸与玻璃或硅石表面结合的条件是本领域技术人员的基本常识。。例如,在Vogelstein,,D,ProcNatlAcadUSA76(1979)615-9中,建议了一种在碘化钠存在的条件下,核酸从琼脂糖凝胶结合到磨碎的燧石玻璃上的方法。Marko,,等,AnalBiochem121(1982)382-7中描述了在高***酸钠存在的条件下,在玻璃粉尘上从细菌中纯化质粒DNA。在DE-A3734442中,描述了利用乙酸使噬菌体颗粒沉淀,用高***酸盐溶解噬菌体颗粒,在玻璃棉过滤器上分离单链的M13噬菌体DNA。洗涤结合到玻璃棉过滤器上的核酸,随后用含甲醇的Tris/EDTA缓冲液洗脱。Jakobi,R,等,AnalBiochem175(1988)196-201描述了一个相似的从λ噬菌体中纯化DNA的方法。该方法需要在离液盐溶液中选择性结合核酸与玻璃表面,而且要将核酸从琼脂糖,蛋白或细胞残余物等污染物中分离出来。为了从污染物中分离玻璃颗粒,颗粒可以被离心或液体抽吸通过玻璃棉过滤器。但是,这是一种限制步骤,它使得这一程序不能用于处理大量的样品。在本发明一个优选的实施方案中,通过添加盐和乙醇,磁性玻璃颗粒沉淀后用于结合核酸,正如Alderton,,等,AnalBiochem201(1992)166-9和PCTGB91/00212中所描述的。
在本发明的一个非常优选的实施方案中,固相是磁性玻璃颗粒,优选地是未修饰的玻璃表面。磁性玻璃颗粒是一种小磁性核心在玻璃中的固体分散体,即它们是玻璃小滴,其中分散着非常小的磁性物体。那些提到的磁性物体是接近磁铁的,例如铁或铁磁的或超顺磁性的材料。顺磁性的物质是没有用的,因为它们仅仅是非常微弱地接近有磁性,对于本发明的方法,其磁性是不够的。优选的是铁或铁磁