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专利名称:乙醛-乙醇脱氢酶基因的制作方法
技术领域:
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种乙醛-乙醇脱氢酶基因。
背景技术:
乙醇代谢是葡萄糖代谢的一部分,1分子葡萄糖分解为2分子***酸,1分子***酸转变为1分子乙酰辅酶A,乙酰辅酶A在乙醛脱氢酶ALDH催化下生成乙醛,再在NADH(烟酰***腺嘌呤二核苷酸)参与下由乙醇脱氢酶ADH催化乙醛转化为乙醇。从生物制氢角度看,依据NADH偶联产氢假说,生成乙醇会消耗NADH,减少氢产量;从新能源角度看,乙醇是一种重要的工业原料,可以做工业酒精,可以做燃料乙醇,作为再生能源对替代和缓解我国石油不足具有重要意义,是加快开发替代能源和新能源,实现能源消费结构多源化的有效措施;推行燃料乙醇可以给国家带来刺激农业发展、完善能源安全体系、减少对石油的依赖程度、节约外汇、增加就业、增加财政收入、改善燃油品质等巨大的综合收益。使用乙醇作为汽车燃料,可以明显降低汽车废气的排放,有效改善大气环境质量。研究表明,乙醇生产和乙醇燃烧中的C循环封闭,排放的CO2重新被乙醇生产原料吸收,明显减缓全球变暖。综上所述,克隆乙醛-乙醇脱氢酶基因无论从生物制氢角度,还是从新能源角度都是有重要意义的。
产氢菌B49是哈尔滨工业大学林明博士从生物制氢反应器的乙醇型发酵活性污泥中分离出的一株高产氢乙醇型发酵菌株,生理生化和分子生物学鉴定结果证实为一新种或者新属。该菌株已在中国微生物菌种保藏中心保藏,保藏编号为CGMCC1153。·drycell·h,-culture,产氢能力居于国际前列。其菌株特征为单胞生长的规则杆菌;周生鞭毛;G+;无荚膜;无芽孢;专性厌氧;乳白色圆形菌落;;在28~43℃,pH=~。B49酵解葡萄糖的主要发酵产物为乙醇、乙酸、H2、CO2和乳酸,参见任南琪提出的新型有机废水发酵类型-乙醇型发酵的代谢途径推测B49酵解葡萄糖的代谢途径(见图1)。由此可见,乙醛-乙醇脱氢酶基因的克隆对研究其代谢工程提高产氢量是重要的。
发明内容
鉴于乙醛-乙醇脱氢酶基因的克隆对研究产氢菌B49代谢工程提高产氢量有很重要的作用,本发明旨在从EthanologenbacteriumhitB49基因组中分离乙醛-乙醇脱氢酶基因,扩大乙醛-乙醇脱氢酶基因资源,从而为EthanologenbacteriumhitB49的代谢工程研究和构建基因工程菌提供科学依据。本发明所述的乙醛-乙醇脱氢酶基因
Badh是以高效产氢菌EthanologenbacteriumhitB49总DNA为模板,通过PCR扩增获得的。本发明的乙醛-乙醇脱氢酶基因Badh基因全长3098bp,其中A、C、G、T分别为797(%)、850(%)、744(%)、707(%)。在277bp处有起始密码子ATG,在2889bp处有终止密码子TAA,在204bp到249bp之间存在一个启动子序列TTGCAACTTGCAAAAAAGTATCGTATAATAATATTGATAATATTTTAACA。该序列无内含子,具有2616bp完整的开放读码框,编码871个氨基酸。,。通过GenBank基因序列比对分析,表明与已注册的乙醛-乙醇脱氢酶同源性为52~65%,其中与BacilluslicheniformisATCC14580和BacilluslicheniformisDSM13的乙醛-乙醇脱氢酶基因同源性最高,为65%,证明是一个新的乙醛-乙醇脱氢酶基因,将分离的乙醛-乙醇脱氢酶基因与原核表达载体pet-22b连接,构建成pet-22b-ADH重组表达载体,经IPTG诱导后表达出100~120kD的目的蛋白,证实该基因是一个具有表达功能的基因。本发明从EthanologenbacteriumhitB49基因组中分离乙醛-乙醇脱氢酶基因,扩大了乙醛-乙醇脱氢酶基因的资源,从而为EthanologenbacteriumhitB49的代谢工程研究和构建基因工程菌提供了科学依据。
图1为产氢菌B49的代谢途径,图2为pMD18-T载体的结构图谱,图3为pMD18-T载体的酶切位点结构图,图4为TaKaRaLAPCRTMinvitrocloningKit试剂盒的PCR扩增原理图,图5为特异性引物设计位置图,图6为pet-22b载体的结构图谱,图7为pet-22b载体的酶切位点结构图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式所述的EthanologenbacteriumhitB49乙醛-乙醇脱氢酶基因Badh是以高效产氢菌EthanologenbacteriumhitB49总DNA为模板,通过PCR扩增获得的。本实施方式对该基因进行了原核表达检测,同时也对该菌株进行了乙醛-乙醇脱氢酶活力测定。其具体方法如下1、乙醛-乙醇脱氢酶基因的克隆(1)PCR引物的设计根据GenBank中收录的细菌乙醛-乙醇脱氢酶蛋白质序列,具体菌种见表1,经clustalw多序列比对分析,找出10块无间隙高度保守的氨基酸序列区(Blocks)。把这十个保守区域的蛋白质序列转换为简并核苷酸序列,并计算简并度,经过筛选选用了一对简并引物,该引物的序列参见表2。
表1设计乙醛-乙醇脱氢酶基因简并引物所用乙醛-乙醇脱氢酶蛋白质的菌种
-乙醇脱氢酶的简并引物
注NA、C、T或G,YC或T,WA或T,SC或G,KG或T,RA
或G,B非A。
(2)EthanologenbacteriumhitB49基因组总DNA的提取取EthanologenbacteriumhitB49菌液约50mL,用上海华舜生物工程有限公司生产的华舜小量细菌基因组DNA抽提试剂盒提取,提取步骤参见小量细菌基因组DNA抽提试剂盒操作手册。
(3)乙醛-乙醇脱氢酶基因部分片段的PCR扩增
以EthanologenbacteriumhitB49总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系1xBuffer,,引物ADHJ1-forward、ADHJ1-,,~1μg,加ddH2O至50μL。反应程序预变性95℃,5min,94℃,30s;55℃降到35℃,每次降1℃,40s;72℃,2min30s,共20个循环;然后按94℃,30s;35℃,40s;72℃,2min30s,共23个循环,最后在72℃延伸10min,4℃保存。
(4)PCR产物的克隆PCR产物用上海华舜生物工程有限公司生产的柱式华舜小量胶回收试剂盒回收,方法参照试剂盒小量胶回收操作手册。回收产物与pMD18-T克隆载体连接,连接体系pMD18-T载体1μl(50ng),PCR产物2μl(100~200ng),LigationSolution5μl,加ddH2O至10μl。16℃过夜连接。。在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选,并提取白斑菌落质粒进行菌落PCR以鉴定阳性重组子。其中
a、①~16h,挑取单菌落接入不含抗生素的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
②,37℃。
③将菌液分装于两个预冷的50ml无菌离心管中,冰浴30min。
④4℃,4000rpm,离心10min,弃上清。
⑤,重悬菌体,冰浴30min。
⑥4℃,4000rpm,离心10min,弃上清。
⑦,重悬菌体。
b、①取200μl感受态细胞,置于冰上,加入4μl连接产物,轻轻旋转混匀内容物。
②冰浴30min。
③42℃水浴中热激90s,勿摇动。
④冰浴2~3min。
⑤加入800μl无附加抗生素的LB培养基,混匀,37℃200~250rpm摇床振荡预表达培养45~60min。
⑥室温,4000rpm,离心5min,弃去900μl上清液,余液将菌体悬浮。
⑦将细菌涂布在附加50mg/LAmp、4μlIPTG和40μlX-gal的LB固体培养基上。
⑧平板于37℃正向放置至液体被吸收,然后倒置培养过夜。
c、阳性重组子的筛选及鉴定①蓝白斑反应筛选阳性重组子根据α-互补反应的原理,在附加X-gal和IPTG的筛选培养基上产生的白色菌落为带有重组质粒的菌落,蓝色菌落为带有重新环化载体的菌落,因此白色菌落可初步鉴定为阳性重组子。
②阳性重组子的菌落PCR鉴定挑取白斑菌落,利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR,PCR条件95℃预变性10min;94℃30s,50℃30s,72℃90s,共35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。%琼脂糖凝胶电泳,若电泳显示出与目的DNA大小的条带,则证明质粒重组正确,是阳性重组子。
本实施方式中采用的pMD18-T是一种常用的克隆载体,大小为2692bp,具有Amp抗性基因;带有一段大肠杆菌lacZ的调控序列和N-端146个氨基酸的编码信息,此编码区插入了多克隆位点,若无外源基因插入,载体会与大肠杆菌lacZ的C-端序列功能互补,即α互补,产生有完整活性的β-半乳糖苷酶;若有外源基因插入,则破坏了其读码框,产生无α互补能力的肽段,因此,在附加X-gal和IPTG的筛选培养基上白色菌落为带有重组质粒的细菌,蓝色菌落为带有重新环化载体的细菌。本实施方式所述pMD18-T载体购自大连宝生物工程公司,其pMD18-T质粒图谱及其酶切位点见图2和3。
(5)DNA序列测定与分析阳性重组子选用Invitrogen上海英俊生物技术有限公司自动序列分析仪进行序列测定,序列同源性比较在
。
(6)克隆乙醛-乙醇脱氢酶基因部分片段两侧序列CassettePCR的引物设计采用TaKaRaLAPCRTMinvitrocloningKit试剂盒克隆乙醛-乙醇脱氢酶基因片段两侧序列。以已克隆的乙醛-乙醇脱氢酶基因片段序列为基础,设计与试剂盒中CassetteprimerC1,CassetteprimerC2引物分别匹配的上游引物ADH-S11-lower,ADH-S12-lower和下游引物ADH-S21-upper,ADH-S22-upper,具体序列见表3。
-乙醇脱氢酶基因部分片段两侧序列的CassettePCR引物
其中,CassettePCR的原理和引物设计要求如下a、CassettePCR原理具体原理见图4。因为在设计上,Cassette的5′末端没有磷酸基,所以TargetDNA的3′末端和Cassette的5′末端的连接部位形成缺口。在第一次PCR反应的第一个循环时,从PrimerC1开始的延伸反应在连接部位终止,限制了PrimerC1和PrimerC1同一引物之间的扩增,从而控制了非特异性PCR扩增。只有从PrimerS11或PrimerS21开始延伸合成的DNA链,才能成为PrimerC1的模板,进行DNA的特异性扩增反应。再用内侧Primer(PrimerC2,PrimerS12或S22)进一步进行第二次
PCR反应,可以高效特异性地扩增目的DNA。
当蛋白质的氨基酸序列已知时,可以根据已知信息设计Mixedprimer,扩增编码蛋白质的cDNA。
本试剂盒的具体操作步聚如下1)用EcoRI或BamHI限制酶将EthanologenbacteriumhitB49基因组DNA完全分解。
2)与具有EcoRI或BamHI限制酶酶切位点的Cassette接头进行连接反应。
3)用CassettePrimer(PrimerC1)和根据已知区域的DNA序列设计的Primer(PrimerS11或PrimerS21),进行第1次PCR(1stPCR)反应。
4)取3)的PCR反应液的一部分作模板,使用内侧Primer(PrimerC2和PrimerS12或PrimerS22)进行第2次PCR(2ndPCR)反应,特异性地扩增目的DN***段。
b、SpecificPrimer(S11或S21,S12或S22)的设计标准1)根据已知区域设计Primer(见图5)。设计方向为需要扩增的未知区域的方向。S2的位置应设计在S1的内侧,两个引物间的距离没有严格的规定。
设计引物时还需要注意以下几点①引物长度为20~35mer(扩增长链DNA时最好为30~35mer)。
②GC含量在50%左右,避免局部GC或AT集中。特别是引物的3端不要AT集中。
③引物自身不要形成发夹等明显的二级结构。
④两个SpecificPrimer(S11或S21、S12或S22)要与CassettePrimer(C1、C2)组合使用,所以设计时还要考虑不要与配对的引物形成引物二聚体,特别是3′端的3、4个碱基不要与配对的引物序列互补。
2)根据蛋白质的氨基酸序列进行设计引物时应注意以下几点①首先将氨基酸序列转换成编码氨基酸的碱基序列。应尽量选择简并少的区域设计引物,但与简并少而较短的引物相比,还不如使用简并多而较长的引物比较合适。
②如果想减少引物简并,可考虑Codonusage进行设计。
③3′末端不要简并。
④如果使用Mixedprimer进行PCR扩增时,需要将退火温度降低,而其结果往往会引起非特异性的扩增。如果有关DNA序列信息较多时,可进一步在内侧再设计一个引物,用以鉴定目的DN***段。
(7)克隆乙醛-乙醇脱氢酶基因部分片段两侧序列的CassettePCR扩增根据已克隆的乙醛-乙醇脱氢酶基因片段序列,分析该序列的限制性内切酶位点情况,找出该序列没有的限制性内切酶,而TaKaRaLAPCRTMinvitrocloningKit试剂盒中有该酶接头的限制性内切酶,具体过程如下乙醛-乙醇脱氢酶下游的扩增选用EcoRI限制性内切酶酶切B49基因组DNA,酶切后的基因组DNA和EcoRI接头于16℃连接3h;乙醛-乙醇脱氢酶下游的扩增选用BamHI酶切