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优选第二节蛋白质一级结构的测定方法
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由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信息更多,因此有不少电子数据库问世,储存的序列资料以惊人的速度不断扩充,并且个人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新蛋白质的序列,研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比较,确定其中是否存在同源性。这些数据库中比较有名的就是美国NationalBiomedicalResearshFoundation(国家生物医学研究基金会)主持的PIR(ProteinInformationResource,蛋白质信息库或ProteinIdentificationResouece蛋白质鉴定库),美国政府支持的GeneBank[GeneSequenceDataBank(基因序列数据库)],还有欧洲的EMBL(EuropeanMolecularBiologyLaboratory,欧洲分子生物学实验室数据库)。
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PDB(ProteinDataBank):蛋白质结构数据库
PDB原来有由美国Brookhaven国家实验室负责维护和管理,为适应结构基因组和生物信息学研究的需要,1998年由美国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助,成立结构生物学合作研究协会(ResearchCollaboratoryforStructureBioinformatics,RCSB)PDB由RCSB管理。
PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库
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二、蛋白质一级结构的测定方法
研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构从氨基酸算起,已有150年的悠久历史,直到1955年,Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序,为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。
目前关于核酸的一级结构研究,由于Sanger等发明了加减法,可以得到了突飞猛进的发展。对比之下,关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。
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但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱(GCMS)等方法的相继出现。使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少,而且工作人员也大大减少。
当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间,今天运用自动化仪器,分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天,可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用,蛋白质一级结构测定方法的综述及专著文献较多。
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三测定前的准备工作
测序前的准备工作:
  蛋白质的纯度鉴定
要求:纯度97%以上,均一。
鉴定方法:
⑴聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE)要求一条带,双向电泳。
⑵DNS—Cl(二甲氨基萘磺酰***)法测N端氨基酸。
(3)亲和层析
(4)western印迹法等
测定蛋白质的分子量
估算氨基酸残基数,确定肽链数
方法:SDS-PAGE,凝胶过滤法,沉降系数法
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及测定的一般步骤 蛋白质分子的一级结构测定,概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及-S-S-定位等。
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蛋白质测序的一般步骤
(1)   测定蛋白质分子中多肽链的数目。
(2)   拆分蛋白质分子中的多肽链。
(3)   断裂链内二硫键。
(4)分析多肽链的N末端和C末端。
(5)   测定多肽链的氨基酸组成。
(6)   多肽链部分裂解成肽段。
(7)   测定各个肽段的氨基酸顺序
(8)   确定肽段在多肽链中的顺序。
(9)   确定多肽链中二硫键的位置。
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一级结构的测定方法
1)肽链的拆开
蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链,采用的化学处理方法有:
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