文档介绍：大量提取质粒DNA(CsCl 密度梯度离心法)
大量提取质粒DNA(CsCl 密度梯度离心法) 来源: 2011-6-9 访问量:3520
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大量提取质粒DNA(CsCl 密度梯度离心法) 2010-7-7
大量提取质粒DNA(CsCl 密度梯度离心法)
李渊越
1. 预约摇床、超速离心机。
2. 配 TB 培养基(1L 锥形瓶中装250 ml 培养液),并灭菌。质粒做好转化,并涂板。
3. 第一天早上,往 TB 中加入适量的Amp 或Kana。挑菌,37 ℃摇床培养 24 h,至OD600 到10-15。
4. 检查以下药品:25% sucrose in 50 mM Tris-HCl()>250mL、lysozyme 粉末>1g、 M EDTA
()>50mL、RNase A(100 mg/ml)>150uL、Triton-lysis>100mL、PEG8000>300mL、1×TE>150mL、
CsCl>250g、正丁醇>2 瓶、EB>2mL。
5. 第二天早上,把菌液倒入离心瓶中,用 Beckman J6-MI 离心机以4,200 rpm, 20 min 离心。离心后,把
上清倒干。在离心的时候,配Lysozyme 25mL。并将RNase 置于室温。
6. 弃上清,以 20ml 25% sucrose in 50 mM Tris-HCl(),重悬至菌完全分散。
7. 加入 4ml 新配制的lysozyme-EDTA-RNase 溶液。混匀,室温静置10 min 以上。
8. 在静置的同时,准备好高速离心管,往里面各加入 5ml Triton-lysis。
9. 将 lysozyme-EDTA-RNase-DNA 溶液倒入高速离心管中,使用JA- Ti 转头,100,000g, 15min。
10. 将上清倒入新管中(不要把沉淀倒出来),加入PEG8000 使总体积至50mL(1/2 体积),颠倒混匀,
于4 ℃中放置2 h 以上(过夜更好)。
11. 4,000 g 5 min,去上清, TE,溶解至无沉淀。
12. 加入 g(要精确到小数点后2 位,便于配平)CsCl,溶解完全。
13. 在超离管中用 200ul 枪加入100ul EB(2mg/ml),将溶液通过20mL 一次性注射器移入超离管中,用
TE 将液面补平至近管口。
14. 补加 TE 至液面到超速离心管管口。
15. 称出每管重量,配平,封口。任选以下一种条件在 20℃下进行密度梯度离心: 转头转速时间
Type Ti 70,000rpm 20h
NVT65 60,000rpm 16h
NVT65 65,000rpm 8h
16. 灭 250mL 以上的超纯水,并配好至少500mL 灭菌水饱和正丁醇。
17. 超离后,取样品,用5 ml 注射器加上12#针头,抽取EB 带,(离心完可见两条EB 带,上面一条细浅
的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB 带)放入50ml 管中。