文档介绍：实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应
一、实验目的
1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理
2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法
二、实验内容
对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三***反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。
三、实验操作
(一) 双缩脲反应
1、实验原理
当尿素加热到180℃左右时,两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲,双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物,此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键,其结构与双缩脲相似,故能呈此反应,而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。
2、试剂
(1)尿素
(2)10%NaOH溶液
(3)1%CuSO4溶液
(4)蛋白质溶液:将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍,3层纱布过滤,滤液冷藏备用。
3、操作
(1)取少许结晶尿素放在干燥试管,微火加热,则尿素开始熔化,并形成双缩脲,释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化,试管内有白色固体出现,停止加热,让试管缓慢冷却。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO4 2~3滴,混匀后观察颜色的变化。
(2)另取一试管,加蛋白质溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO4 2~3滴,振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。
(二) 茚三***反应
1、实验原理
除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三***作用生成黄色物质外,所有α-氨基酸与茚三***发生反应生成紫红色物质,最终形成蓝紫色化合物。1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。反应的适宜pH为5~7。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。
2、试剂
蛋白质溶液(同前);% 甘氨酸;%茚三***水溶液
3、操作
取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1 ml, ml %茚三***水溶液,混匀,在沸水浴加热2~3分钟,观察颜色变化。
(三) 蛋白黄色反应
1、实验原理
蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等,这类蛋白质可
被浓***硝化生成黄色的硝基苯的衍生物。该物质在酸性环境中呈黄色,在碱性环境中转变
为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸,因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应结果。
2、试剂
(1)蛋白质溶液(同前);(2)头发;(3)指甲屑;(4)%苯酚溶液;(5)%酪氨酸溶液;(6)10%NaOH溶液;(7)浓***(ρ=)
3、操作
取5支试管编号后分别按下表-1所示加入试剂,观察各管出现的现象,若有反应慢者可放置微火(或水浴中)加热,待各管均先后出现黄色后,于室温逐滴加入10%NaOH溶液直至碱性,观察颜色变化。
表1 试验编号
注意:向蛋白质溶液中加浓***时,所出现的白色沉淀是强酸使蛋白质发生变性所致。
(四) 乙醛酸反应
1、实验原理
含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸(CHOCOOH)缩合,形成与靛蓝相似的物质。此反应机理尚不清楚,可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱