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聚丙烯酰***凝胶
聚丙烯酰***凝胶是由丙烯酰***单体(acrylamide,Acr)和交联剂N’N’-甲叉双丙烯酰***(methylene-bisacrylamide,Bis)以29:1的比例在聚合剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate,APS)和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
优点:
凝胶孔径可调节(改变单体和交联剂的浓度),因此可根据被分离物的分子量范围选择合适的浓度
灵敏度可达1mg
分辨率高,可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体
无电渗作用,只要纯度高,操作条件一致,样品分离重复性好
凝胶透明,有弹性,机械效能好
化学性能稳定,与分离物不发生化学反应;对pH和温度变化较稳定
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PAGE电泳原理
分子筛效应:分子大小和形状
电荷效应:,表面负电荷多的蛋白质迁移快,反之则慢
(强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散,并带上大量负电荷,导致本身电荷差别消失,因此SDS-PAGE分离蛋白主要依赖分子大小,而非电荷或形状)
不连续系统具有对样品的浓缩效应
pH值的不连续
缓冲液离子成分的不连续
电位梯度的不连续
凝胶浓度的不连续以及电压的不连续.
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分离胶
(8-15%,)
浓缩胶
(5%,)
加样
加电场,样品浓缩在界面上
电泳结束
—
+
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电泳的应用
测定蛋白质分子量(亚基);结合凝胶过滤层析可用来测定蛋白质的分子量和聚合状态
分析纯度
测定蛋白质的含量
蛋白质水解分析
鉴定修饰(糖基化)
分离纯化
结合WesternBlot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别蛋白质相互作用
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电泳的应用
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测定分子量
蛋白质分子量在15,000~200,000之间时,电泳迁移率与分子量的对数值线性相关:若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可以获得一条标准曲线,而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
注意:①SDS单体的浓度,为保证蛋白质与SDS的充分结合,它们的重量比应该为1:4或1:3;②样品缓冲液的离子强度;③二硫键是否完全被还原,许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的,这一类蛋白质,测定时只是它们的亚基或单条肽链的分子量;④使用软件分析需要图片调正;⑤上样量少,条带越宽分析偏差(偏小)越大。
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测定分子量
非还原/还原蛋白质状态的比较:为什么要用还原性电泳测分子量?
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测定分子量
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测定分子量
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