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专利名称:基因群检测结构的制作方法
技术领域:
本实用新型涉及一种基因群检测结构,尤指涉及一种结构可改进原尼龙膜片操作平台的缺点,特别是指建立全新低成本的WEnCA(WeightedEnzymaticChipArray)操作平台,可辅以自动化操作使检测时间大幅降低,并减少人为操作误差,以达突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。
背景技术:
对基因过渡表现(Overexpression)的分析已经导致疾病诊断之基本进步与临床进展。而研究基因过渡表现的技术包含有北方墨点法(NorthernBlot)、反转录聚合酶链锁JxjSCReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)R^^^mMn-M链锁反应(Real-TimePCR)。其中NorthernBlot由于操作步骤十分敏琐,所需检体量又过多,因此仅限于研究操作上,无法实际应用于临床诊断。至于RT-PCR及Real-TimePCR由于操作步骤简便,因此在单一基因检测的应用上,使用相当广泛,例如肝炎病毒的检测及感染症病原菌的鉴定。然而,虽然PCR序列的发明系作为整体最伟大的实验,但多数PCR技术仍保有特定的共同问题,其主要问题包含有其一是污染,过渡灵敏侦察的伪阳性,例如雾式的DNA或先前的样品残余;其二是RT-PCR仅被认为半定量,因为当比较不同的样品时,难以控制序列放大的效率;以及其三是由于所需引子
(Primer)间黏合(Armearling)的干扰,无论RT-PCR或Real-TimePCR都仅广泛应用于单一基因标的的检测,当检测标的为基因群时,则PCR相关的技术则有操作耗时、费事及高成本等缺点。随着近几年来生物科技的快速发展,生物芯片于临床医学诊断或药效评估上的应用逐渐被重视,本案的先前研究已开发并且评估一尼龙膜芯片(MembraneArray)方法,能使用于癌症诊断,在血液检体(PeripheralBlood)中同时查出一多种mRNA标记引物的表达水平。其分子标志的表达水平由RT-PCR与尼龙膜芯片评估,数据从RT-PCR与尼龙膜芯片取得,且受制于线性回归分析,显示在这两个方法结果之间的高度相互关系(r=,P具体实施方式
请参阅图1至图4所示,分别为本实用新型的立体外观示意图、本实用新型的分解示意图、本实用新型的基因群检测结构示意图及本实用新型的基因检测芯片的基因位置排列示意图。如图所示本实用新型的基因群检测结构(WEnCA-ChipkilDlOO,至少包括机壳60、基因检测芯片10、检体前处理单元20、杂合反应区30、芯片呈色单元40及分析判读单元50所构成。上述所提的机壳60活动收容有第一承载部601、第二承载部602及第三承载部603,而该机壳60中可设有与第一、二及第三承载部601、602、603连接的感应马达
604,使用者除可以手动方式启、闭第一、二及第三承载部601、602、603之外,亦可以感应马达604的配合自动启、闭第一、二及第三承载部601、602、603。上述所提的基因检测芯片10设于第一承载部601中,其上被覆有标定特定序列,为具有建构完整疾病诊断、药效评估或遗传性致病基因的筛检芯片。该检体前处理单元20设于第二承载部602中,系将检体加入裂解缓冲液打破细胞,萃取得mRNA,经由加入磁珠(MagneticPartic1es)与细胞内的RNA结合,将磁珠上的核酸与裂解缓冲液冲洗分离,继而洗提(Elute)出磁珠上的mRNA,并将此纯化而得的mRNA经由反转录为cDNA后,再以酵素标定成探针(Probe),其中,该检体可为血液、体液、细胞培养及组织细胞等。该杂合反应区30设于第三承载部603中,系用以将该探针与该基因检测芯片10进行杂合(Hybridization)反应,并将未反应的探针由芯片上洗净。该芯片呈色单元40设于机壳60中,用以将该基因检测芯片10上杂合后的探针加上二氨基联苯***(Diaminobenzidine,DAB)呈色剂进行呈色反应(ColorDevelopment)。该分析判读单元50设于机壳60的一面上,其内建有分析软件与影像撷取模式及数据传输模式,用以影像撷取模式撷取该基因检测芯片10呈色反应后的影像,并对呈色反应后的影像结果以分析软件进行自动化分析,将分析后所得的侦测值以基因加权计算方式,依据每个基因对于疾病形成或抗药性发生的重要性给予个别加权分数,经由阳性反应基因点乘上基因点的加权值而得到芯片的总分
(TotalScore)。以上所述,构成一全新的基因群检测结构100。本发明主要是针对原尼龙膜片操作平台的缺点,设计改进策略,例如在判读时,针对芯片上每一标的基因不同的重要性给予不同程度的加权(LungCancerRef),另以生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)呈色系统取代原洋地黄毒(Digoxigenin)系统,建立全新的TOnCA(WeightedEnzymaticChipArray)操作平台,另由于此结构易于结合流体控制平台,以自动化操作系统进行,使得检测时间大幅度降低,并减少人为操作差异所产生的误差,进而突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。为进一步了解基因群检测结构于临床医学检测上的实用性,本实用新型于一较佳实施例中,系取得100个临床病理科确认为大肠直肠癌(ColorectalCancer,CRC)患者的血液检体,以先前建构的活化K-ras致癌基因检测芯片(ActivatedK-rasDetectionChip)10分别利用尼龙膜片及本结构100(即TOnCA-Chiphl1)检测检体中K_ras路径相关基因(K_rasPathwayRelatedGenes)过渡表现(Overexpression)的个青形,并比较灵敏度(Sensitivity)、特异性(Specificity)及准确性(Accuracy)的差异,且分析本结构100与原尼龙膜片操作的检测平台于临床应用时,操作时间与所需成本的不同,以更确立本结构
100于临床应用的发展潜力。上述建构的活化K-ras致癌基因检测芯片10,如图4所示,系选定与大肠直肠癌相关的标的基因群,将包含22种目标基因的标的基因群与一内部对照组(InternalControl)及一空白对照组(BlankControl)三重复点阵于一尼龙膜片上,其中,该标的基因群为ATP2A2、ATP6V0B、CXCR4、CYR61、RAP1B、RPL30、BMPR2、CALM2,DVL3,E2F4,SLC25A5、SPP1、CEBPB、CLSTNl、ETS1、H2AFZ、TAF12、TBX19、C0L4A1、CXCL11、L1CAM及LRP1,且该内部对照组为β-肌动蛋白(β-actin)。请参阅图5A及图5B所示,分别为本实用新型的标的基因群在癌组织中过渡表现的比例示意图、及本实用新型的接受者操作特性曲线示意图。如图所示在加权冷光芯片反应的分析上,本实用新型首先整理芯片上22个基因点分别在100个具活化型K-ras突变的癌症组织(cancertissue)中过渡表现的比例,并将之分为四个等级,如图5A所示,基因点在80个以上的癌组织中呈现过渡表现,加权值为4;在7080个癌组织中呈现过渡表现,加权值为3;过渡表现仅在6070个癌组织中存在的基因点,加权值为2;若仅能5060个癌组织中测得过渡表现的基因点,加权值为1。经由两组各100个反应后芯片上阳性反应的基因数,乘上加权值之后,先计算出每一反应后的芯片的总分,而后同样以组织是否实际具有可测得的突变点作为标准参考值。经由生物统计学分析画出接受者操作特性曲线
(ReceiverOperatingCharacteristicCurve,ROCCurve)6,如图5B所示,可看出当判断此芯片阳性反应的基准值(CutoffValue)定为20时,此芯片在组织中的检测结果,其灵敏度可达96%,特异性亦可达97%。请参阅图6所示,为本实用新型癌症组织反应后的芯片影像示意图。如图所示为上述癌症组织反应后的芯片影像图,依带有K-ras基因突变的癌症组织(cancertissuewithK-rasmutation),以CAKM称之;以及依带有原生型K_ras基因的癌症组织(cancertissuewithwildtypeK_ras)以CAKWT称之。其中CAKM-1及CAKM-2反应后的总分分别为36及32,皆>20,因此芯片反应结果为阳性(Positive);CAKWT-l及CAKWT-2反应后的总分分别为8及6,,其特征在于包括机壳,其活动收容有第一承载部、第二承载部及第三承载部;基因检测芯片,设于第一承载部中;检体前处理单元,设于第二承载部中;杂合反应区,设于第三承载部中;芯片呈色单元,设于机壳中;及分析判读单元,设于机壳的一面上。
,其特征在于所述机壳中设有与第一、二及第三承载部连接的感应马达。
专利摘要一种基因群检测结构,至少包括活动收容有第一、二及第三承载部的机壳;一设于第一承载部中的基因检测芯片;一设于第二承载部中的检体前处理单元;一设于第三承载部
中的杂合反应区;一设于机壳中的芯片呈色单元;以及一设于机壳一面上的分析判读单元。藉此,可提供一快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于结合自动化的WEnCA-Chipball操作平台,可进行快速生物检体检测分析,完成传统生医检测上所无法达成的目标。