文档介绍：该【基因恒温扩增方法、基因恒温检测方法和基因缺陷筛查诊断试剂盒的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【11】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【基因恒温扩增方法、基因恒温检测方法和基因缺陷筛查诊断试剂盒的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。基因恒温扩增方法、基因恒温检测方法和基因缺陷筛查诊断试剂盒的制作方法
专利名称:基因恒温扩增方法、基因恒温检测方法和基因缺陷筛查诊断试剂盒的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种基因恒温扩增方法、一种基因恒温检测方法、以及一种基因缺陷筛查诊断试剂盒。
背景技术:
体外基因扩增是涉及基因检测的一项重要内容,目前普遍使用的是PCR技术,这种扩增方式涉及待检测DNA样品、DNA引物、DNA聚合酶以及由4种脱氧核苷酸组成的混合物,在反应过程中,要求温度有一定的周期性变化,以便实现高温条件下的变形、中间温度条件下的退火和低温条件下的延伸,形成新的双链DNA,通过反复的温度循环,基因扩增的产量以指数方式上升,最终达到满意的浓度。由于这种技术需要进行周期性的温度调节,不仅要求复杂的设备,加大了设备投资和操作难度,更无法在一个试剂盒中实现。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷,本发明提供了一种基因恒温扩增方法、一种采用这种恒温扩增方法的基因恒温检测方法、以及一种采用这种基因恒温检测方法的基因缺陷筛查诊断试剂盒。
本发明实现上述目的技术方案是一种基因恒温扩增方法,其采用内切酶对待扩增的靶DNA进行切割,在靶DNA未被修饰的一条链上切开一个缺口,暴露其末端,DNA聚合酶以该切口为起点,合成新链,并将“旧链”剥离,被剥离的单链DNA被作为模板,用于合成新的双链DNA,由此完成一个扩增循环,进入下一个扩增循环,新合成的DNA被用做下一个扩增循环的靶DNA。
一种基因恒温检测方法,主要包括待检测基因的恒温扩增、单碱基延伸和核酸试纸检测这三个步骤,其中所述恒温扩增步骤为采用内切酶对待扩增的靶DNA进行切割,在靶DNA未被修饰的一条链上切开一个缺口,暴露其末端,DNA聚合酶以该切口为起点,合成新链,并将“旧链”剥离,被剥离的单链DNA被作为模板,用于合成新的双链DNA,由此完成一个扩增循环,进入下一个扩增循环后,新合成的DNA被用做下一个扩增循环的靶DNA。
一种基因缺陷筛查诊断试剂盒,其试剂包括用于恒温扩增的内切酶、用于恒温扩增的引物、用于恒温扩增的DNA聚合酶和用于合成DNA的混合原料,还包括用于DNA检测并显示检测结果的核酸试纸条。
由于本发明在扩增中采用了内切酶对靶DNA进行切割,在靶DNA上切出一个切口,形成延伸和合成新链的起点,替代了现有PCR技术下用于变性的高温条件,由此极大地简化了工艺过程,简化了设备,降低了投资和成本,提供了效率。更为重要的是,现有技术可以将所有试剂和试纸设置在一个试剂盒内。由于这种试剂盒成本低,操作和携带都很方便,有利于基因检测的发展,有利于及早发现基因缺陷,及早采取防范措施,提高人们的健康水平。
附图是本发明的试剂盒的外部结构示意图。
具体实施例方式
针对不同的基因缺陷,可以依据现有技术和其他可能的先进技术,对基因进行选择,确定重大出生缺陷性疾病相关基因SNP的位点,收集足够的样品,以保证调查统计数据和结论的可靠性;应依据现有技术和其他可能的先进技术,设计和合成针对各不同基因或基因SNP的特异性引物和特异性探针;应依据检测步骤和要求,加引物到处理过的样品和反应体系中,在优化的实验条件下扩增得到目的片段,将目的片段克隆到表达载体中,建立标准检测物的质粒文库,并通过反复的实验室实验对各种试剂的有效性进行检验和对比,优化检测条件,以保证在实际实施所要求的特异性、敏感度和可靠性。
例如,已知如下几种在中国人中出现频率较高的出生缺陷同特定的基因缺陷有关1)血友病在中国人中发病率为4-8/10万,其中出生婴儿发病率为1/5000,主要是FVIII基因缺陷22内含子倒位引起。
2)%,主要集中在南方省市,%;%,主要集中在南方省市,个别省市高达6%,%为以下基因缺陷引起CD41-42(-TCTT)、IVS-II(C654T)、CD17(A-->T)、TATAboxnt-28、CD71-72(+A)。
3)先天性耳聋在中国人中发病率为1/1500,20%的儿童耳聋病人是Connexin26基因缺陷引起,并且中国人Connexin26基因缺陷主要是235delC。
4)成年型多囊肾在中国人中发病率约为1/200到1/1000,其中85-90%为PKD1基因C10078T和G10158A缺陷。
5)软骨发育不全在中国人中发病率约为1/10000,其中97%为FGFR3基因G1138A和G1138C缺陷。
由于本发明涉及的内切酶、引物和探针等的特异性,多种基因的扩增和检测可以同时进行,可以借鉴芯片理论和技术,并结合本发明的其他技术特点,将与多种基因缺陷(例如上述6种重大出生缺陷)相关的多个基因或基因SNP(例如前面所述的12个基因或基因SNP)的检测集成在一个试剂盒中,即将相应的各种试剂和试纸条等装在同一个试剂盒中,制成操作简便和低成本的六联筛查诊断试剂盒,这样一次就可以同时检测出涉及上述6种出生缺陷的筛查检测结果,不仅仅是减少成本,而起更加有利于推广对新生儿的基因筛查
和检测技术,提高国民身体素质。这种多种基因一起检测的方式也可以应用到本发明的基因恒温扩增方法和基因恒温检测方法。
本发明的恒温扩增方法,可以适用于各种具有特异性内切酶的基因扩增。其使用扩增引物同靶DNA特异性杂交,该扩增引物可以根据具体的被检测基因特别设计,所述内切酶可以是所述扩增引物尾部带有的一段特异性切口核酸内切酶的辨认序列,该切口核酸内切酶辨认特异性DNA序列,只在其未被修饰的一条链上切开一个缺口,暴露其末端,DNA聚合酶以该切口为起点,合成新链,并将“旧链”剥离,被剥离的单链DNA作为模板与扩增引物结合,新合成的双链DNA又恢复了半修饰的内切酶位点,所述切口核酸内切酶将在此位点重新切开一个缺口,这样就进入下一个扩增循环。上述各反应步骤在恒温的条件下反复、连续地进行,DNA呈指数扩增,直到原料耗尽或酶活性丧失。依据申请人的实验,在优化的条件下,30分钟内靶分子可能被扩增数十亿倍。可以理解地是,这种所谓的扩增循环只是依据微观反应过程进行的简单化表述,由于全部反应都是在同样的条件下(恒温)进行的,从宏观上看,整个反应过程是持续的,不会出现象PCR那样的周期性循环。
所述单碱基延伸是在恒温扩增后进行的,加入同种标记的
ddNTP(如ddGTP和ddATP),加入特异标记的延伸引物,以上述恒温扩增产物为模板,在DNA聚合酶作用下将ddNTP延伸上去,进行SBE反应。针对一个特定突变位点,延伸引物也可以设计两条正向延伸引物和反向延伸引物,但延伸引物的3’端碱基必须紧挨于突变碱基,检测时可以选择其中的任意一条引物进行SBE,并根据所选择的延伸引物加入相应的ddNTP。采用通过条带颜色显示特定基因或基因SNP检测结果的试纸条进行检测,以试纸条上有无特异颜色的条带进行分型,若只有加入ddGTP或ddATP情况下的试纸条出现条带,表明被检者该位点基因型为野生型或纯合突变型,若未加入ddGTP或ddATP情况下的试纸条也出现条带,则表明其该位点基因型为杂合突变型。
参见附图,本发明的基因缺陷筛查诊断试剂盒的盒体一般应为封闭的,并设有盖。这样整个检测过程,包括核酸扩增、单碱基延伸和试纸条检测在内,都是封闭进行的,反应体系的所有反应物(包括试剂)放置在同一试剂包装中,反应自动按顺序完成,核酸产物一直被密封在试剂包装(盒体)内,不造成核酸扩增物污染。并且,这种试剂盒体积小,可以非常方便地携带和使用。
所述盒体上可以设有透明的窗口,盒体内用于检测的试纸条放置在该窗口的内侧,不用打开盒体就可以方便地观察到试纸条颜色。
由于用试纸条检测蛋白质在国内外已是通用试剂,可以借鉴试纸条检测蛋白质的技术实现试纸条对核酸的检测。
所述试纸条上可以设有纳米级(一般在40nm左右)的乳胶颗粒,所述乳胶颗粒上标记有特异性的核酸或蛋白质分子。所述试剂还可以包括特定的核酸探针,根据特异性免疫反应的原理,通过所述特定的核酸探针,可以把扩增后的待测产物和连着乳胶颗粒的核酸或蛋白质分子连成一体,以达到检测目的。如果试纸条出现显色效果,可判断检测的样品为阳性,如果无目标检测物,则特异性探针将不能把扩增产物与标记物连接,导致无法显色。
所述用于合成DNA的原料可以是相应4种脱氧核苷酸的混合物,各种试剂可以依照适宜的比例溶入蒸馏水,以方便使用。
本发明试剂盒涉及的各种试剂均可以采用关于基因恒温扩增方法和基因恒温检测方法的技术内容,这些技术特征均可以体现在试剂盒中,故不再赘述。
权利要求
,其特征在于采用内切酶对待扩增的靶蒂娜进行切割,在靶蒂娜未被修饰的一条链上切开一个缺口,暴露其末端,DNA聚合酶以该切口为起点,合成新链,并将“旧链”剥离,被剥离的单链DNA被作为模板,用于合成新的双链DNA,由此完成一个扩增循环,进入下一个扩增循环,新合成的DNA被用做下一个扩增循环的靶DNA。
,其特征在于使用扩增引物同靶DNA特异性杂交,该扩增引物根据具体的被检测基因特别设计,所述内切酶是所述扩增引物尾部带有的一段特异性切口核酸内切酶的辨认序列。
,主要包括待检测基因的恒温扩增、单碱基延伸和核酸试纸检测步骤,特征在于所述恒温扩增步骤为采用内切酶对待扩增的靶蒂娜进行切割,在靶蒂娜未被修饰的一条链上切开一个缺口,暴露其末端,DNA聚合酶以该切口为起点,合成新链,并将“旧链”剥离,被剥离的单链DNA被作为模板,用于合成新的双链DNA,由此完成一个扩增循环,进入下一个扩增循环,新合成的DNA被用做下一个扩增循环的靶DNA,如此反复循环。
,其特征在于使用扩增引物同靶DNA特异性杂交,该扩增引物根据具体的被检测基因特别设计,所述内切酶是所述扩增引物尾部带有的一段特异性切口核酸内切酶的辨认序列。
,其特征在于所述单碱基延伸是在恒温扩增后进行的,加入同种标记的ddNTP,加入特异标记的延伸引物,以前述恒温扩增产物为模板,在DNA聚合酶作用下将ddNTP延伸上去,进行SBE反应。
,其特征在于在所述单碱基延伸步骤种,针对一个特定突变位点,延伸引物可以设计两条正向延伸引物和反向延伸引物,但延伸引物的
3’端碱基必须紧挨于突变碱基,检测时选择其中的任意一条引物进行SBE,并根据所选择的延伸引物加入相应的ddNTP,采用通过条带颜色显示特定基因或基因SNP检测结果的试纸条进行检测,以试纸条上有无特异颜色的条带进行分型,若只有加入ddGTP或ddATP情况下的试纸条出现条带,表明被检者该位点基因型为野生型或纯合突变型,若未加入ddGTP或ddATP情况下的试纸条也出现条带,则表明其该位点基因型为杂合突变型。
,其特征在于其试剂包括用于恒温扩增的核酸内切酶、用于恒温扩增的引物、用于恒温扩增的DNA聚合酶和用于合成蒂娜的混合原料,还包括用于DNA检测并显示检测结果的核酸试纸条。
,其特征在于同一个试剂盒中有与若干种基因缺陷相关的若干种基因或基因SNP的检测试剂和试纸条,盒体是封闭的,并设有盖,还设有透明的窗口,盒体内用于检测的试纸条放置在该窗口的内侧,盒内放置有一种或多种基因所需的试剂和试纸条。
,其特征在于其特征在于使用扩增引物同靶DNA特异性杂交,该扩增引物根据具体的被检测基因特别设计,所述内切酶是所述扩增引物尾部带有的一段特异性切口核酸内切酶的辨认序列。
,其特征在于所述单碱基延伸是在恒温扩增后进行的,加入同种标记的ddNTP,加入特异标记的延伸引物,以前述恒温扩增产物为模板,在DNA聚合酶作用下将ddNTP延伸上去,进行SBE反应,所述延伸引物可以设计两条正向延伸引物和反向延伸引物,但延伸引物的3’端碱基必须紧挨于突变碱基,检测时选择其中的任意一条引物进行SBE,并根据所选择的延伸引物加入相应的ddNTP,采用通过条带颜色显示特定基因或基因SNP检测结果的试纸条进行检测,以试纸条上有无特异颜色的条带进行分型,若只有加入ddGTP或ddATP情况下的试纸条出现条带,表明被检者该位点基因型为野生型或纯合突变型,若未加入ddGTP或ddATP情况下的试纸条也出现条带,则表明其该位点基因型为杂合突变型。
全文摘要
本发明涉及一种基因恒温扩增方法、一种基因恒温检测方法以及一种基因缺陷筛查诊断试剂盒。其采用内切酶对待扩增的靶蒂娜进行切割,在靶蒂娜未被修饰的一条链上切开一个缺口,暴露其末端,DNA聚合酶以该切口为起点,合成新链,并将“旧链”剥离,被剥离的单链DNA被作为模板,用于合成新的双链DNA,并使用扩增引物同靶DNA特异性杂交,该扩增引物根据具体的被检测基因特别设计,所述内切酶是所述扩增引物尾部带有的一段特异性切口核酸内切酶的辨认序列,在进