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基于木糖苷酶的工程菌及其实现方法
一种基因工程领域的木糖苷酶的工程菌,以灰略红链霉菌基因组DNA为模板,与含有酶切位点和聚组氨酸标签的引物进行PCR扩增得到编码木糖苷酶的核苷酸序列;然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体,再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内,获得木糖苷酶过表达重组菌株。本发明针对现有技术存在的由于木糖苷酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足,应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成,此外本发明通过在表达重组蛋白C端添加聚组氨酸标签的方法,提高蛋白活性的同时也保证了纯化后木糖苷酶的纯度;此外,本发明通过载体信号肽实现了目的蛋白的周质空间表达,提高了木糖苷酶的活性。
【专利说明】基于木糖苷酶的工程菌及其实现方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株,具体是一种灰略红链霉菌的基于木糖苷酶的工程菌及其实现方法。
【背景技术】
[0002]木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物,是植物通过光合作用产生的主要干物质,主要包括纤维素、半纤维素和木质素。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程,它涉及众多酶系的参与。
[0003]木质纤维素中的半纤维素组分是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体,这些糖是五碳糖和六碳糖,包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。半纤维素主要分为三类:聚木糖类、聚葡萄甘露糖类和聚半乳糖葡萄甘露糖类,其中聚木糖类是以1,4-β-D-吡喃型木糖构成主链,以4-氧***-吡喃型葡萄糖醛酸为支链的多糖;聚葡萄甘露糖类是由D-吡喃型葡萄糖基和吡喃型甘露糖基以1,4-β型连接成主链;另一类聚半乳糖葡萄甘露糖类则还有D-吡喃型半乳糖基用支链的形式以1,6-α型连接到此主链上的若干D-吡喃型甘露糖基和D-吡喃型葡萄糖基上。半纤维素的主要降解酶有内切-β-1,4-木聚糖酶(Endo-β-1,4-xylanases)和β-1,4-木糖苷酶(β-1,4-xylosidase),其中木糖苷酶主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖,水解产物为木糖。因此,木糖苷酶在半纤维素彻底水解过程中起十分关键的作用。
[0004]木糖苷酶在自然界分布非常广泛,现已从细菌、真菌(包括酵母)等微生物和高等植物中分离得到。与真核生物木糖苷酶基因相比,细菌木糖苷酶基因具有不含内含子、易克
隆、易表达及种类多等优势。其中灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)是一种常见的土壤细菌。然而之前链霉菌研究重点集中在如何改造其代谢途径以提高抗生素的发酵产量,对其基因组内其他功能基因的开发和利用还相对不足。
[0005]与大多数细菌相比,链霉菌具有较为复杂的生长分化机制,对大分子多糖物质如半纤维素有很强的分解利用能力。因此,研究链霉菌对半纤维素的分解利用机制,发掘全新的半纤维素酶基因序列并通过基因工程手段实现目的基因进行外源表达,对新型半纤维素酶制剂的开发乃至生产具有重大意义。
[0006]经过对现有技术的检索发现:中国专利文献号CN101429518公开(公告),公开了一种耐高温木糖苷酶XynB2和编码该酶的基因与应用,该技术由嗜热脱氮芽抱杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因组DNA借助PCR扩增而得到的木糖苷酶XynB2构建表达载体在大肠杆菌中表达出该基因编码的重组木糖苷酶。该酶的最适反应温度为65°C,,在偏酸性环境中热稳定性好。适合分解寡聚木聚糖产生木糖。但该技术所得到的重组木糖苷酶的环境适宜能力依旧难以满足现有工业需要。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术存在的由于木糖苷酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足,提出一种基于木糖苷酶的工程菌及其实现方法,能够应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成,此外本发明通过在重组蛋白添加聚组氨酸标签的方法,方便了后期蛋白的纯化,所得到的木糖苷酶除对高温(最适反应温度为50°C)具有将强的耐受能力外,还可在碱性环境(-)下维持稳定的酶学活性,具有广泛的工业用途。。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0009]本发明涉及一种木糖苷酶的工程菌,该工程菌为外源表达木糖苷酶的大肠杆菌。
[0010]所述的胞内木糖苷酶具体为灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)JSD-1木糖苷酶编码基因,即木糖苷酶SG-,该核苷酸序列为1518bp,共编码505个氨基酸,。
[0011]所述的木糖苷酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。
[0012]所述的灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)JSD-1,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(
CGMCC),,保藏日期为2012年1月9日,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。
[0013]本发明涉及上述工程菌的实现方法,以灰略红链霉菌基因组DNA为模板,与含有酶切位点和聚组氨酸(HIS6·Tag)标签的引物进行PCR扩增得到编码木糖苷酶的核苷酸序列SG-X0;然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体pET-22b(+),再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内,获得木糖苷酶过表达重组菌株。
[0014]所述的含有酶切位点和聚组氨酸标签的引物,即含有MscI和EcoRI酶切位点引物具体包括:
[0015]X0-MscI-F:GATGGCCATGGTGATCCACGTGCCCGCGGAGCC
[0016]X0-EcoRI-R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGTCCCGGCCGAGCA
[0017]所述的PCR扩增的条件为:98°C预变性3min;98°C变性10s,68°C延伸45s;30个循环后68°C终延伸3min。
[0018]所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
[0019]本发明涉及一种木糖苷酶的工程菌的应用,将其用于木糖苷酶的体外高效表达,
并将木糖苷酶用于木糖的工业发酵生产。技术效果
[0020]现有木糖苷酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低,因此严重限制了其使用范围和效果;与现有技术相比,本发明提供了一种全新的木糖苷酶基因序列;通过构建外源表达载体,实现了木糖苷酶的外源高效表达,并通过在表达重组蛋白C端添加聚组氨酸标签(HIS6·Tag)的方法,提高蛋白活性的同时也保证了纯化后木糖苷酶的纯度;此外,本发明通过载体信号肽实现了目的蛋白的周质空间表达,提高了木糖苷酶的活性;所述的木糖苷酶在如高温及碱性的特殊条件下具有更稳定的酶学特性。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为灰略红链霉菌木糖苷酶信号肽预测图。
[0022]图2为灰略红链霉菌木糖苷酶在不同碳源诱导下表达量示意图。
[0023]图3为重组木糖苷酶(HIS6·Tag)体外表达SDS-PAGE验证图。
[0024]图4为重组木糖苷酶(HIS6·Tag)在不同pH下相对酶活性示意图。
[0025]图5为重组木糖苷酶(HIS6·Tag)在不同温度下相对酶活性示意图。
【具体实施方式】
[0026]下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1
[0027]本实施例包括以下步骤:
[0028]步骤1)灰略红链霉菌的分离及培养
[0029]灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)分离自上海市浦江镇收集的腐烂結杆,。将该菌种接种于LB液体培养基,32°C培养48h。
[0030]上述LB液体培养基组分为:,,,-。-。
[0031]步骤2)灰略红链霉菌基因组DNA提取
[0032],12000rpm离心2min。弃上清,收集菌体沉淀,加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20yLEDTA溶液(,),37°C处理45min,加入4yLRNaseA(100mg/mL),震荡混匀15s,室温放置5min,随后按照细菌DNA提取试剂盒(TIANGEN)操作说明完成剩余操作,得到高纯度基因组DNA。%琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量,确保无明显RNA条带,基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0033]步骤3)灰略红链霉菌基因组测序
[0034]确定全基因组鸟枪法(WGS)策略,采用第二代测序技术,构建不同插入片段长度的文库,采用Miseq(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据,对带接头、低质量的数据进行过滤,,构建contigs及scaffolds,最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
[0035]步骤4)蛋白编码基因功能预测
[0036]。基因预测模型选取自我训练基因预测模型,即提取拼装序列中最长的序列,以该序列作为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型,对所有序列进行基因预测,设定开放阅读框的长度为ll〇bp,。
[0037]步骤5)木糖苷酶膜定位预测
[0038],如图1所示。结果表明木糖苷酶不存在明显的信号肽序列,推测该酶为胞内酶。
[0039]步骤6)灰略红链霉菌总RNA的提取
[0040]将链霉菌JSD-1接种于以水稻秸杆(纤维素、木聚糖、果胶、木质素或葡萄糖)为唯一碳源的无机盐培养基,
32°C、150rpm条件下培养72h。离心收集菌体沉淀,并按细菌总RNA提取试剂盒要求(TIANGEN)提取高纯度的链霉菌总RNA。
[0041]上述无机盐培养基组分为:,,,MgS04·,CaCl2·,FeS04·,水稻秸杆(纤维素、木聚糖、果胶、木质素或葡萄糖)10.〇g/L。
[0042]步骤7)灰略红链霉菌木糖苷酶表达水平测定
[0043]根据木糖苷酶基因序列,,引物序列如下:
[0044]X0-F:CCACGCCGACTCCTTCTCCT
[0045]X0-R:GGTGGTAGGTGGGTTTGCGG
[0046]同样的,根据16SrRNA的特异性序列设计引物,并作为内参基因,引物序列如下:
[0047]16SrRNA-F:CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0048]16SrRNA-R:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0049]以链霉菌总RNA模板进行反转录获得cDNA文库,并按照荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)要求进行相关操作。设置三个重复,待实验完成收集处理数据,分析在不同碳源诱导作用下,木糖苷酶的表达量(如图2)。结果表明,当以水稻秸杆与木聚糖为碳源进行诱导时,该木糖苷酶的表达量显著上调,证明该酶参与半纤维素的代谢过程。
[0050]上述的荧光定量PCR的反应条件为:95°C预变性30s;95°C变性10s,60°C退火30s,72°C延伸15s,共40个循环。
[0051]步骤8)木糖苷酶表达载体构建
[0052]根据木糖苷酶基因序列,设计含有酶切位点和聚组氨酸(HIS6·Tag)标签的引物如下:
[0053]X0-MscI-F:GATGGCCATGGTGATCCACGTGCCCGCGGAGCC
[0054]X0-EcoRI-R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGTCCCGGCCGAGCA
[0055]以灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)基因组DNA为模板,用含有MscI和EcoRI酶切位点引物进行PCR扩增获得木糖苷酶基因序列,使用DNAA-TailingKit加A后连接到T-VectorPMDTM19-T(TaKaRa),并将连接产物转入DH5α大肠杆菌内。挑选阳性克隆,摇菌提取质粒测序。MscI和EcoRI进行双酶切(37°C),回收木糖苷酶DN***段X0。用相同内切酶酶切表达载体pET-22b(+)并回收载体DN***段。将X0与载体片段混合,T4DNALigase(TaKaRa)过夜连接(16°C),将连接产物转入DH5a大肠杆菌感受态细胞内,通过抗性平板及菌落PCR筛选含有目的基因的表达载体的阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(1〇〇μg/mL)的LB液体培养基中,