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专利名称:含基底膜的人工皮肤构建方法及人工皮肤的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种含基底膜的人工皮肤构建方法和人工皮肤,属于组织工程技术领域。
背景技术:
人工皮肤又称组织工程皮肤,是指运用工程科学和生命科学的原理和方法,从根本上认识正常和病理状态下哺乳动物的皮肤组织结构功能关系,并研究皮肤生物学替代物以恢复、维持和改进皮肤组织功能。目前,人工皮肤主要有两个应用方向一,体内应用于各类皮肤创伤的修复;二,体外应用于各种毒理药理学的动物替代方法的检测和科学研究。随着人们对动物福利和动物保护的重视,基于人工皮肤的动物替代毒理药理的检测和研究得到了迅速的发展。皮肤是由表皮、真皮和皮下层构成。表皮和真皮之间为基底膜,!m的薄膜,主要由表皮层的角质形成细胞和真皮层的成纤维细胞通过分泌相互作用形成。表皮层的基底层细胞以半桥粒等结构与基底膜形成连接,在人工皮肤的构建过程中,该结构能够显著增强人工皮肤的机械强度和可操作性,基底膜也是人工皮肤的支架,基底膜的形成效率和形成质量对于人工皮肤的构建具有很重要的影响。现有的构建人工皮肤的方法中,中国专利
,来促进基底膜形成,本发明和基底膜形成促进剂为植物提取物,本方法涉及的原料众多,其制备比较麻烦,不适合大规模推广;,通过调节培养基中的钙浓度和添加外源性层粘蛋白来促进促进基底膜形成,本方法只能从外部环境上改善基底膜形成的条件,提高成本的同时只能间接的影响基底膜形成,目前尚未有直接促进基底膜形成的方法。C0L4A1基因(IV型胶原alpha1基因)是编码IVa1胶原的基因,IVa1胶原是IV胶原家族的重要成员,而IV型胶原是基底膜的主要组成结构,它与层粘连蛋白、蛋白多糖和巢蛋白共同形成基底膜的网状结构,因此C0L4A1基因对于基底膜的形成具有重要的促进作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处,提供一种含基底膜的人工皮肤构建方法和人工皮肤。本发明的含基底膜的人工皮肤构建方法,包括以下步骤(1)将C0L4A1基因转染到成纤维细胞中,制备稳定高表达C0L4A1基因的成纤维细胞(Fb-C0L4A1);(2)以第(1)步中的Fb-C0L4A1为支持细胞,与皮肤角质形成细胞共培养,构建人工皮肤。优选地,
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本发明的含基底膜的人工皮肤构建方法,包括以下步骤(1)构建C0L4A1基因载体;(2)将C0L4A1基因载体转染到培养的皮肤成纤维细胞中,筛选出过稳定高表达C0L4A1基因的细胞克隆,在37°C、5%C02的培养箱中扩增培养,得到稳定高表达C0L4A1基因的成纤维细胞;(3)以第(2)步中获得的稳定高表达C0L4A1基因的成纤维细胞为支持细胞,以(2-5)X105个/ml的浓度添加到细胞孔板中,在37°C、5%C02的培养箱培养2_5天后,将皮肤角质形成细胞以(3-10)X105/ml的浓度添加到插入式培养皿内,放入细胞孔板中,37°C、5%C02的培养箱培养2-7天后,再进行10-20天的气液面培养,构建人工皮肤。更优选地,所说的构建C0L4A1基因载体选自带有C0L4A1基因的质粒、慢病毒、腺病毒或逆转录病毒载体。本发明的人工皮肤,是利用权利要求1-3中任一项的方法所构建的人工皮肤。本发明具有如下技术效果通过转染C0L4A1基因到成纤维细胞中,直接促进基底膜形成,利用本法构建的人工皮肤,其基底膜生长速度快,密度高,强度高,能有效支撑固定人工皮肤。说明书附1是对实施例1中对经过基因转染的成纤维细胞和对照组的成纤维细胞的C0L4A1蛋白表达进行westernblotting分析的结果图;图2是对实施例1中构建的人工皮肤基底膜C0L4A1蛋白进行免疫荧光染色分析的结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
来对本发明作进一步的详细说明。实施例1实验组本实施例的构建方法,包括以下步骤(1)构建C0L4A1基因质粒载体;(2)将C0L4A1基因质粒载体转染到培养的皮肤成纤维细胞中,筛选出过稳定高表达C0L4A1基因的细胞克隆,用含10%FBS的DMEM培养液,在37°C、5%C02的培养箱中扩增培养,得到稳定高表达C0L4A1基因的成纤维细胞;(3)以第⑵步中获得的稳定高表达C0L4A1基因的成纤维细胞为支持细胞,以(2-5)X105个/ml的浓度添加到细胞孔板中,在37°C、5%C02的培养箱培养2_5天后,将皮肤角质形成细胞以(3-10)X105/ml的浓度添加到插入式培养皿内,放入细胞孔板中,37°C、5%C02的培养箱培养2-7天后,再进行10-20天的气液面培养,构建人工皮肤。对照组以没有转染C0L4A1基因的皮肤成纤维细胞为支持细胞,按照上面第(3)步的方法构建人工皮肤。结果分析1)对转染后的成纤维细胞和对照组的正常成纤维细胞进行westernblotting分析C0L4A1蛋白表达,A为实验组,B为对照组,如
图1所示,显示转染后的成纤维细胞中,
4C0L4A1蛋白的表达量显著高于正常成纤维细胞组;2)对实施例中构建的人工皮肤基底膜C0L4A1蛋白进行免疫荧光染色分析,如图2所示,显示基底膜上C0L4A1基因表达量很高。从上述结果可以得知,本实施例的方法能够构建含基底膜的人工皮肤。
权利要求
含基底膜的人工皮肤构建方法,其特征在于,包括以下步骤(1)将COL4A1基因转染到成纤维细胞中,制备稳定高表达COL4A1基因的成纤维细胞;(2)以第(1)步中的稳定高表达COL4A1基因的成纤维细胞为支持细胞,与皮肤角质形成细胞共培养,构建人工皮肤。
,其特征在于,包括以下步骤(1)构建C0L4A1基因载体;(2)将C0L4A1基因载体转染到培养的皮肤成纤维细胞中,筛选出过稳定高表达C0L4A1基因的细胞克隆,在37°C、5%CO2的培养箱中扩增培养,得到稳定高表达C0L4A1基因的成纤维细胞;(3)以第⑵步中获得的稳定高表达C0L4A1基因的成纤维细胞为支持细胞,以(2-5)XlO5个/ml的浓度添加到细胞孔板中,在37°C、5%CO2的培养箱培养2_5天后,将皮肤角质形成细胞以(3-10)X105/ml的浓度添加到插入式培养皿内,放入细胞孔板中,37°C、5%CO2的培养箱培养2-7天后,再进行10-20天的气液面培养,构建人工皮肤。
,其特征在于,所述的C0L4A1基因载体选自带有C0L4A1基因的质粒、慢病毒、腺病毒或逆转录病毒载体。
-3中任一项的方法所构建的人工皮肤。
全文摘要
本发明提供了一种含基底膜的人工皮肤构建方法,包括下列步骤(1)将COL4A1基因转染到成纤维细胞中,制备稳定高表达COL4A1基因的成纤维细胞;(2)以第(1)步中的稳定高表达COL4A1基因的成纤维细胞为支持细胞,与皮肤角质形成细胞共培养,构建人工皮肤。本发明还提供了一种人工皮肤。本发明具有如下技术效果通过转染COL4A1基因到成纤维细胞中,直接促进基底膜形成,利用本法构建的人工皮肤,其基底膜生长速度快,密度高,强度高,能有效支撑固定人工皮肤。