文档介绍：抗氨苄青霉素的构造及在大肠杆菌类的表达
摘要:本实验利用 PCR技术在大肠杆菌中扩增获得了一段序列,并克隆至 p GEM-T -easy载体,获得了重组质粒。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析,重组质粒的大小为4000 bp ,扩增片段大小为950bp,当重组质粒DNA转入大肠杆菌后,重组菌能在含氨苄青霉素的LB培养基上生长。
关键词;大肠杆菌氨苄青霉素 PCR
1 材料和方法
CaCl溶液、LB液体培养基、氨苄青霉素、 mmol/L dNTP混合物、Tap酶、引物对、LB固体培养基、大肠杆菌、PCR试剂盒、PCR试剂盒、PEGM-T-easy 载体系统、 DNA Marker
超净工作台、恒温摇床、低温离心机、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳系统、PCR热循环仪、 1. 3 PCR扩增
制PCR反应体系(取 DNA 模板 1μL ,上、、dNTPs 2μL、Taq 酶 ,加去离子水至 25μL) ;
PCR 循环参数:94℃预变性1. 0min ,然后94 ℃变性1. 0 min ,47 ℃退火1. 0min ,72 ℃延伸 1. 5 min 。
共进行 35个循环,72 ℃再延伸 10. 0 min ,4 ℃保温。取 PCR 扩增产物 3μL 琼脂糖凝胶中进行电泳,观察扩增片段的大小。
PCR产物的回收
将 PCR产物用苯酚2氯仿混合物、氯仿各抽提 1次,无水乙醇沉淀,12 000 r/ min 离心 10 min ,弃上清,回收沉淀。
基因重组
将PCR 产物与 PGEM-T-easy载体系统以适宜比例混
合,37 ℃作用 3 h ,进行纯化,在连接体系14 ℃水浴过夜。
大肠杆菌感受态
,在LB培养基中37℃振荡培养12h左右,对数生长期时稀释50-100倍振荡扩大培养,OD600,<。
ml 离心管中冰上冷却10-30min,4℃、40000r/min离心10min.
倒尽上清液,用500(分三次200、 200、 100)ml氯化钙()悬浮细胞,4000r/min离心10min。
,,冰上放置片刻后,制成感受态细胞悬液
细胞转化
,冰上放置
20-30min.
于42℃- LB溶液培养基,使其体积到1ml。摇匀后37℃震荡培养45-60min.
-12h.
质粒DNA的提取
挑取LB培养基上生长的单菌落,经2mlLB液体培养基(含相应抗生素)37℃振荡培养12h后,8000r/.(苯酚/氯仿/异戊醇1:1:1)400μl预冷的70%乙醇洗涤2次,4℃离心(8000r/min、