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专利名称:发酵的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种经D-山梨糖醇发酵转化以高产率制备2-***基-L-古洛糖酸的方法。
2-***基-L-古洛糖酸是制备L-抗坏血酸的重要的中间体,它可按熟知的赖希斯坦方法进行转化。
用发酵的方法从D-山梨糖醇或L-山梨糖生产2-***基-L-古洛糖酸是已知的。
因此,日本专利公报第40154/1976号公开了用醋酸杆菌,杆菌或假单胞菌属的微生物从山梨糖醇生产2-***基-L-古洛糖酸的方法,这些菌属在需氧条件下具有氧化D-山梨糖醇以生产2-***基-L-古洛糖酸的能力。但该已知方法的产率非常低,即低于6克/升。
按“中国微生物学报”21(2),185-191(1981)公开的另一已知方法,2-***基-L-古洛糖酸可用包括沟槽假单胞菌(Pseudomonasstriata)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)的微生物混合培养物从L-山梨糖制备,其产率当起始L-山梨糖浓度为70克/升时为30克/升,当起始L-山梨糖浓度为100克/升时为37克/升。
此外,欧洲专利公报第0221707号公开了一种用糖生***假葡糖杆菌(Pseudogluconobactersaccharoketogenes)与伴生细菌一起或其自身从
L-山梨糖生产2-***基-L-古洛糖酸的方法。但该已知的用糖生***-(-%)(见欧洲专利公报第0221707号第13页,表4)。
还有,欧洲专利公报第0278447号公开了一种用微生物的混合培养物从L-山梨糖生产2-***基-L-古洛糖酸的方法,,(一种巨大芽孢杆菌菌株)的分类特点)。此法产率为40克/升或更高。
如上所述,有各种从L-山梨糖或D-山梨糖醇制备2-***基-L-古洛糖酸的微生物的试验方法,但由于低的产率使它们距离工业应用还差很远,特别是作为从D-山梨糖醇起始的方法,本发明的方法能使产率最少约为60克/升,130克/升的产率是可达到的。
另一方面,从D-山梨糖醇发酵生产L-山梨糖是已知的,该法是赖希斯坦法的一部分。
已知各种醋酸杆菌(在此分类为葡糖杆菌)菌株如木质醋酸杆菌和弱氧化醋酸杆菌能有效地从D-山梨糖醇生产L-山梨糖(Biotechnology、Volume6a,436-437,1984,editedbyH-,,Germany)。
假如人们能建立一种有效地从如D-山梨糖醇的便宜的碳源起始而不是从
L-山梨糖起始制备2-***基-L-古洛糖酸的方法,显然,将大大简化赖希斯坦方法。
如上所述,-山梨糖生产2-***基-L-古洛糖酸,但从D-山梨糖醇的转化率则很低。从D-山梨糖醇生产2-***基-L-古洛糖酸的低转化率是由于形成了如D-葡萄糖,D-葡萄糖酸和2-***基-D-葡萄糖酸这些从D-山梨糖醇衍生来的副产物。从2-***基-L-古洛糖酸的立体异构体2-***基-D-古洛糖酸中纯化2-***基-L-古洛糖酸是困难的,-山梨糖醇的可能的代谢途径如下所示
-山梨糖醇发酵制备2-***基-L-古洛糖酸的产率,考虑利用某些方法尽可能多地增强L-山梨糖的形成途径。
因此本发明的目的是提供一种新的以高转化率从D-山梨糖醇制备2-***基-L-古洛糖酸的方法,例如转化率至少约为50mol%到约89mol%。
本发明的另一目的是提供一种操作方式,其中可防止不需要的如D-葡萄糖,D-葡萄糖酸和2-***基-D-古洛糖酸的副产物的产生。
本发明是一种制备2-***基-L-古洛糖酸或其盐的方法,它包括在含有D-山梨糖醇的培养基中培养一种具有从D-山梨糖醇生产L-山梨糖能力的属于葡糖杆菌或醋酸杆菌属的微生物
(A)和一种具有从L-山梨糖生产2-***基-L-(B),其功能等价物,亚培养物,突变体或变异体的混合培养物,借此进行混合培养,其中所说的两种微生物在整个培养期的至少一部分时间内是共存于培养基中的,并回收2-***基-L-古洛糖酸或其盐。
此外,按照本发明,用L-山梨糖生产菌株从D-山梨糖醇生产出的L-山梨糖可被2-***基-L-古洛糖酸生产菌株所利用以形成2-***基-L-古洛糖酸。另外,基本上没有观察到前面提到的副产物的积累。
关于这一点,在此使用的具有从D-山梨糖醇生产L-山梨糖能力的微生物(A)属于葡糖杆菌属或醋杆菌属,所用的微生物(B),其功能等价物,亚培养物,突变体或其变异体具有从L-山梨糖生产2-***基-L-。
在本方法中,得到的任何产物,例如通过处理微生物(A)和(B)的细胞,例如,静止细胞,冻干细胞或固定化细胞均可被使用。
本方法可用各种方法进行,例如,一种将两种微生物(A)和(B)在培养开始时同时接种到培养基中的方法,一种先接种微生物(A),在培养一段时间后随后接种微生物(B)的方法,另一种方法是将两种微生物(A)和(B)分别接种到各自的培养基中,然后在培养一定时间后将其中任一种一次全部,分成几份或不断加入到另一个的肉汁中,紧接着是另一种培养期。
对本发明的方法来说,任何适宜的方法均可用于需培养的微生物,例如,根据被使用的各个微生物的特性改变其混合的方法。即,一种需被接种的微生物的量与另一种微生物的量的比率和接种的次数应根据各个微生物的生长速率及涉及到的微生物产生L-山梨糖的能力和将L-山梨糖转化成2-***基-L-古洛糖酸的能力,并以所用培养基的性质为基础来进行优选和确定。在某些情况下,处理细胞得到的产物还可用作任一种生长着的细胞的替代物。
能被用于本发明方法中的微生物(A),包括那些在公共保藏单位(培养物保藏中心),如日本大阪发酵研究所(IFO)保存,任何人根据要求可以得到的微生物,这些微生物如下所列微生物(A)的实例弱氧化葡糖杆菌IFO3130
弱氧化葡糖杆菌IFO3255弱氧化葡糖杆菌IFO3256弱氧化葡糖杆菌IFO3257弱氧化葡糖杆菌IFO3258弱氧化葡糖杆菌IFO3289弱氧化葡糖杆菌IFO3290弱氧化葡糖杆菌IFO3291GluconobactergluconicusIFO3171GluconobactergluconicusIFO3285GluconobactergluconicusIFO3286赤褐色葡糖杆菌IFO3244微白色葡糖杆菌IFO3251微白色葡糖杆菌IFO3253GluconobacterindustriusIFO3261GluconolactercerinusIFO3262GluconobactercerinusIFO3263GluconobactercerinusIFO3265GluconobactercerinusIFO3266Gluconobac
tercerinusIFO3267GluconobactercerinusIFO3270GluconobacterdiacetonicusIFO3273
GluconobacterrosuasIFO3990醋化醋杆菌奥尔兰亚种IFO3259醋化醋杆菌醋亚种IFO3281液化醋杆菌IFO12257液化醋杆菌IFO12258液化醋杆菌IFO12388醋化醋杆菌木质亚种IFO3288醋化醋杆菌木质亚种IFO13693醋化醋杆菌木质亚种IFO13772醋化醋杆菌木质亚种IFO13773能用于本发明方法的微生物(B)的主要分类特点是负氧化酶试验乙醇被氧化成乙酸D-葡萄糖被氧化成D-葡萄糖酸和2-***基-D-葡萄糖酸;多醇的生***作用;从甘油基本上得不到二羟基***;从D-葡糖二酸产生2-***基-D-葡糖二酸,但从D-葡萄糖,D-果糖,D-葡萄糖酸,D-甘露糖醇或2-***基-D-葡萄糖酸则得不到2-***基-D-葡糖二酸;外观上是多形型的而不是鞭毛型的;从D-果糖产生褐色色素;当在巨大芽孢杆菌或其细胞提取物存在下共培养时能观察到良好的生长;并对链霉素是敏感的。
与微生物(B)相关的特定和优选的微生物已经按布达佩斯条
约于1987年3月17日存放于theDeutscheSammlungVonMikroorganismeninGoettingen,(该研究所现地址为DeuscheSammlungVonMikroorganismenandZellkulturenGmbh,MascheroderWeg1b,D-3300Braunschweig,联邦德国)。该微生物是一种氧化葡糖杆菌微生物。
进一步优选的微生物是前面提及的微生物的功能等价物、亚培养物,突变体或变异体。
在本发明优选的实施方案中,前面所说的微生物(A)和(B)可在包含有D-山梨糖醇的培养基中进行接种和培养,且这些微生物的细胞,例如,静止细胞或任何处理过的从细胞得到的产物可被用于直接对D-山梨糖醇发生作用。任何已知的手段作为微生物培养技术通过使用曝气搅拌液面下发酵器可被采用的方法均是特别优选的,较好的结果可以通过使用液体肉汁培养基的培养来获得。
关于培养微生物(A)和(B)所用的营养培养基,尽管未提出特别的限制,水溶液营养培养基可以含有碳源和氮源。可被微生物利用的其它无机盐,少量其它养分等适于微生物的良好培养。培养基中可适当地含有那些通常用于微生物更好生长的各种营养物质。
除在本发明中用作原料的D-山梨糖醇外也可加入其它碳源物质如丙三醇,D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-果糖、D-阿糖醇等。
在本发明中各种有机或无机物也可用作氮源,如肉汁、胨、酪蛋白,玉米浆、尿素,氨基酸、***盐,铵盐等。硫酸镁,磷酸钾,***化铁和***化亚铁,碳酸钙等无机物也可被使用。
这些营养成分的混合比率及每种成分的量可随所用微生物的属特性,原料D-山梨糖醇的量,被接种的一种微生物相应于另一种微生物的量和接种次数而变化,并可按各种情况特点选择和确定其他的培养条件。
培养基中起始物D-山梨糖醇的浓度也可随所用微生物的属特性等而变化。D-山梨糖醇可在培养开始点一次加入到培养基中,或在培养期间分次加入。在本发明的方法中。分次加入D-山梨糖醇将得到更可取的结果。通常采用D-山梨糖醇的总浓度约为20到250克/升,更可取的是总浓度为约50至200克/升。
培养条件可依所用微生物的种属特性而变化,当然培养基的组成可按不同情况的特点进行选择和确定以便最有效地产生所需产物,尽管可维持培养温度约13至36℃,较可取的是约在18到33℃,,。正常情况下,培养期在20到80小时就足够了,在此周期内在培养基内形成的所需产物达到最大值。
为保持培养基的PH值使其最适宜酶的活性,任何适宜的酸碱试剂均可在培养期中的合适时间以合适的量加入到培养基中。这一目的还可以通过在培养开始时向培养基中加入适当的缓冲剂来达到。
在培养基中如此制得的2-***基-L-古洛糖酸可按已知的常规方法进行分离和纯化,且它可以盐的形式被分离出来,例如钠,钾,钙,铵盐等,该盐用已知的常规方法转化成游离的酸。
分离可按下列步骤的适当结合或重复来进行,例如,通过成盐或利用产物与周围杂质性质的不同,如在溶剂间溶解性,吸附性和分配系数的不同进行分离。例如在离子交换树脂上的吸附是一种方便的分离产物的方法,如此获得的产物可以惯用的方法如重结晶或色谱法进行进一步纯化。
因此,按该新方法收集的2-***基-L-古洛糖酸能很容易地进行分离,如,通过下列步骤培养肉汁的上清液在离心过滤后减压下浓缩,向浓缩液中加入一种有机溶剂如乙醇,将得到的2-***基-L-古洛糖酸结晶以盐的形式分离出来,例如以钠盐或钙盐的形式分离。无论是使用上面的方法还是其它已知的方法,2-***基-L-古洛糖酸总是可以很容易地进行分离。
如此获得的2-***基-L-古洛糖酸或其盐可通过酯化,然后通过烯醇化和内酯化直接转化成L-抗坏血酸。
能使用的培养方法包括静置培养,振摇培养,液面下培养等。对于批量培养,使用分批,分批加料和连续操作技术的液面下培养是最适用的,还可使用微生物
(A)和(B)的固定化细胞,固定化的方法是在如纤维素,陶瓷或玻璃珠等材料上的吸附,在如琼脂、藻酸钙,K-角叉胶和其它的已知的聚合物的凝胶基质上的截留方法。这一方式使得微生物可被反复使用。
(B),而表1中所列的微生物用作微生物(A)。种子培养物的制备种子培养物可按如下所述的两种不同方法进行制备。
方法1在一试管(18mm×200mm)中装入5毫升培养基(SCM)D-山梨糖醇2%,酵母提取物[面包酵母(OrientalYeast)]%,%,%,%,%,%,%,%()并用高压灭菌器在121℃灭菌20分钟。将一菌环的微生物(A)和一菌环的微生物(B)接种到试管中,并在30℃下振荡(220rpm)培育一天。
方法2将一菌环的微生物(B)和一菌环的微生物(A)接种到含有5毫升SCM的试管(18mm×200mm)中并在30℃下振荡培养一天,取一滴形成的培养液铺展于琼脂培养基上,在SCM中含琼脂2%,在30℃下培育4天,在琼脂培养基上生长的微生物以混合物状态可作为接种物被直接用于下面的液体培养。将一菌环上述混合物接种到含有5毫升SCM的试管中并在