核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的测定.doc

文档介绍：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的测定
实验06 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的测定
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase,RuBPCase)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶,是植物中最丰富的蛋白质,主要存在于叶绿体的可溶部分,总量约占叶绿体可溶蛋白50%~60%。本实验用分光光度法测定酶的羧化能力。
一、原理
在RuBPCase的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶I(NADH),由辅酶I氧化的量就可计算RuBPCase的活性,由340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氧化的量。为了使NADH的氧化与CO2的固定同步,从而需要加入磷酸肌酸(Cr~P)和磷酸肌酸激酶的ATP再生系统。ADP+Cr~P磷酸肌酸激酶ATP+Cr
二、材料、仪器设备
(一)材料:菠菜叶片、小麦及水稻叶片。
(二)仪器设备:1. 紫外分光光度计;2. 冷冻离心机,3. 匀浆器;4. 移液管;5. 秒表。
(三)试剂:1. 5mmol/LNADH;2. 25mmol/L RuBP;3. NaHCO3
;4. RuBPCase提取介质:40mmol/L()Tris-HCl缓冲溶液,内含10mmol/L MgCl2、 EDTA、5mmol/L 谷胱甘肽;5. 反应介质:100mmol/L Tris-HCl缓冲液,内含12mmol/L EDTA-Na2,;6. 160u/ml 磷酸肌酸激酶溶液;7. 160u/ml 甘油醛-3-磷酸脱氢酶溶液;8. 50mmol/L ATP;9. 50mmol/L 磷酸肌酸;10. 160u/ml 磷酸甘油酸激酶溶液;11. 菠菜的RuBPCase提取液。
三、实验步骤
1. 酶粗提液的制备取新鲜菠菜叶片10g,洗净擦干,放匀浆器中,加入10ml预冷的提取介质,高速匀浆30S,停30S,交替进行3次;匀浆经4层纱布过滤,滤液于20000×g 4℃下离心15min,弃沉淀;上清液即酶粗提液,置0℃保存备用。
2. RuBPCase活力测定按下表配制酶反应体系
3. 反应介质
4. 将配制好的反应体系摇匀,倒入比色杯内,以蒸馏