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植物转录因子dst在调控植物结实率及提高植物抗高温能力中的应用的制作方法
本发明公开了水稻转录因子dst在调控高温下植物结实率以及植物抗高温能力中的应用,其中,所述转录因子dst包括含有如SEQ?ID?。本发明还公开了水稻转录因子dst调控高温下植物结实率的方法以及提高植物抗高温能力的方法。本发明克隆得到一个调控水稻高温胁迫下结实率和提高植物耐高温能力的主效基因。本发明在农业领域特别是提高作物对高温的耐受性和提高作物结实率方面具有重要的应用前景。
【专利说明】植物转录因子dst在调控植物结实率及提高植物抗高温能力中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物学及功能基因组学领域,尤其涉及一种水稻转录因子DST作为一种负调控因子,在提高高温情况下的水稻结实率以及抗高温能力的方法及应用。
【背景技术】
[0002]在全球气候变暖的大环境下,极端天气频繁发生,高温已经成为制约水稻产量和品质的主要因素之一。2013年许多地区的温度和保持高温的天数均创历史新高,严重影响了稻米产量与品质。然而要寻求在日益飙高的温度下水稻产量受到较小的威胁,培育耐高温的水稻品种是防止高温热害最简便有效的途径,现代分子技术的发展和水稻功能基因组研究的深入,为水稻耐
高温遗传机制的剖析提供了有效手段,而水稻耐热性机制的阐明和耐热相关基因的克隆、鉴定及功能解析是水稻耐热育种的重要基础。
[0003]水稻热害形成是由多种因素共同作用的结果,其中气候因子是造成水稻高温热害的最主要原因之一,在水稻营养生长期和生殖生长期,外界温度高于其最适生长温度一定范围,就可能造成热害。在水稻生殖生长期受到热害造成产量的损失要远大于营养生长期,其中又以水稻开花期受到高温影响最大,籽粒灌浆期次之。大量的研究表明高温胁迫影响水稻的生长发育、产量、品质以及生理生化特性。
[0004]在水稻耐热性遗传研究方面,早期研究发现遗传因素是决定水稻品种间耐热性差异的主要原因之一。近年来,随着分子标记技术的发展和广泛应用,出现了一些利用分子标记对水稻耐热性进行数量性状基因定位研究的报道。曹立勇等对水稻籼粳交IR64XAZucena的DH群体以高温处理后的结实率与大田结实率差值为指标,定位了开花结实期6个耐热性主效QTL,在8条染色体间还检测到8对上位性QTL。Zhuetal.(ZhuCL,XiaoYHiWangCM,[J].RiceScience
,2005,12(I):33-38.)利用98个回交重组自交群体,以适温粒重与高温粒重差值除以适温粒重的百分比作为水稻耐热性指标,在第1、4、7号染色体上共定位到3个灌衆期耐热性的主效QTL、8对上位性QTL。Craufurdetal.(CraufurdPQ,JagadishSV,WheelerTR,[C].Abstract,aninternationalworkshopon“coolriceforawarmerwold”,2007.)在用Bala与Azucena为亲本构建的186个RILs中,共定位到6个水稻耐热性QTL和I个细胞膜热稳定性QTL。陈庆全利用人工气候室模拟自然高温条件,在水稻开花期对水稻籼籼交202个重组自交系群体进行了耐热性鉴定,共检测到7个抽穗开花期耐热性主效应QTL以及7对上位性QTL。在不同时期处理和采用不同鉴定指标进行的这些研究中,检测的耐热位点在第1、2、4、5和8染色体上分布较多,但这些研究定位QTLs的图谱精确性不强,贡献率不高,因此有待于进一步研究验证其结果。另外检测的耐热位点在12条染色体上均有分布,耐热QTL的区间较大,多个区间的上位性效应也影响水稻的耐热性,且定位的耐热位点对表型性状的解释率也有很大的差异,说明水稻耐热性的遗传基础非常复杂。因此要开展分子标记辅助选择分子育种尚需对这些区域进行精确定位。
[0005]近年来随着植物中一些热胁迫相关突变体的获得和转基因实验的进展,人们对植物耐热性有了更加深入和全面的了解。从植物中获得了一些与耐热相关基因,其中以热激蛋白基
因与热激转录因子基因为多。
[0006]热激蛋白(Hsp)是一个大的基因家族,包括HsplOO、Hsp90、Hsp70(Dnak)、Hsp60(GroE)和Hsp20或sHsp等成员(NoverL,BhartiK,D□ringP,:Howmanyheatstresstranscriptionfactorsdoweneed?[J]CellStressChaperones,2001,6:177-189.),多数参与生物体正常的生长发育过程(Satyaletal,1998)0蛋白质组学分析发现,水稻耐热品种N22在38°C高温胁迫下Hsp的表达量很高,其中Hsp20或sHsp在高温胁迫下表达量最高,表明其在细胞抵抗热胁迫中发挥重要的作用(SanieevKB,KwanYC,MarkusF,:acomplexgamewithchaperonesandmorethantwentyheatstresstranscriptionfactors[J].,29(4):471-487;PortM,TrippJ,ZielinskiD,-CIIascoregulatorandcytoplasmicretentionfactoroftomatoheatstresstranscriptionfactorHsfA2[J].,135:1457-1470)。Hong等报道拟南芥HSPlOl的一个突变系表现为热敏感,将HSPlOl的反义链转入拟南芥后检测到
HSP101的表达量下降,植株耐热性丧失;过表达HSP101的植株对极端高温的耐受性明显高于野生型,对玉米HSP101突变体的研究也得到了与拟南芥相似的结果。通过半定量RT-PCR分析了水稻中9个热激蛋白基因的表达模式,它们在不同的组织中存在各自不同的表达方式。所有的9个OsHSP基因受热处理强烈诱导,不受到冷处理诱导。现有研究表明热应激转录因子(Hsfs)是热胁迫防御响应中的中心调节子。Liu等(Jin-GeLiu,Qiu-1inQin,ZhenZhang,R1-HePeng,A1-shengXiong,Jian-MinChen,Quan-,OryzasativaL.,encodesatranscriptionfactorthatfunctionsasahightemperaturereceptiveandresponsivefactor[J].BMBreports,2009,42(1):16-21)利用酵母杂交的方法从水稻中克隆到3个A类热激转录因子基因,其中0sHSF7被发现其表达水平对温度迅速响应,过量表达0sHSF7的单子叶转基因植物,能够在热处理时上调保护作用的基因如热休克蛋白。Yamanouchi等通过图位克隆定位水稻斑点叶基因Spl7的候选基因时在第5染色体上发现I个ORF和热胁迫转录因子高度相似,编码HSF蛋白。籼粳稻基因组中至少共存在25个Hsf基因,其中0sHsfA2a,OsHsfA2c,OsHsfA2e,OsHsfA4a,OsHsfB2b,OsSHFClb专一性地受热胁迫诱导表达。根据OsHsfs蛋白的结构将Hsf分为HsfA,B,C三个家族,热胁迫下
A类Hsfs比B,C两类有更高的表达。水稻中已经鉴定克隆19种Hsf,拟南芥中有21种,但对Hsf功能了解尚浅。
[0007]当热胁迫发生时植物体内的活性氧含量在较短时间内(约15min)上升并超过其阈值,这一信号可被组氨酸激酶和热激转录因子所感受,热激转录因子中感受H2O2信号主要是HsfA4a,HsfA5对该通路起到负调控的功能,当活性氧信号减弱,HsfA5与HsfA4a形成异聚体,阻止HsfA4a形成有活性的同源三聚体,将调控通路中止。Hsfs可将信号通过促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)信号通路传递到下游的转录因子,主要包括锌指蛋白Zat家族、WRKY转录因子家族、MBFlcjPNADPH过氧化物酶(Rboh)。已有报道锌指蛋白Zat家族成员中对热胁迫响应的主要是Zat7、ZatlO和Zatl2。其中Zatl2是APX调控通路所必需的,并且控制了下游42个胁迫响应相关的基因。Zatl2对Zat7的表达起到直接的调控作用。WRKY转录因子家族中WRKY25对氧化胁迫进行响应,并且该响应依赖Zatl2的协助。MBFlc是高度保守的转录辅激活物,在热胁迫下表达量提高。将MBFlc基因敲除的植株表现出热敏感性,并且不能积累SA和海藻糖,表明MBFlc位于SA和海藻糖热胁迫响应通路的上游,对其起到调控作用。
[0008]AP2/ERF家族是植物中存在的一类特殊转录因子,拥有共同的保守
DNA结合结构域,并且多个成员在植物逆境胁迫响应中发挥重要的作用,其中,DREB家族成员可在胁迫条件下激活胁迫响应基因的表达,而DREB2类调节因子主要响应热胁迫,DREB2转录因子包括DREB2A和DREB2B两类。在在水稻中起主要作用的是0sDREB2B基因编码的蛋白,并且该基因具有选择性剪接的功能。在正常生长条件下,该基因则剪接形成终止密码子,产生无功能的蛋白,在热胁迫条件下,该基因编码产生全长蛋白,调控下游热胁迫响应基因。
[0009]同时,一些研究者开展了高温胁迫下水稻花器相关性状的基因定位研究,涉及到花药发育过程、花药裂药的基因控制及逆境条件下与花粉发育密切相关的基因,以期调控花期,减少或避免高温对水稻花器的伤害,提高水稻结实率。Zhu等在粳稻品种日本晴的花药不开裂突变体中发现了一个控制花药开裂的基因aidl,此基因存在于叶和穗中,是一个能编码一个262个氨基酸的蛋白,目前该基因已被定位于水稻第六染色体上。已有的研究发现控制花药开裂的基因可能有多个,表明水稻开花裂药是一个非常复杂的过程,需要进一步的研究来揭示其分子机理。
[0010]目前,有关DST作为锌指转录因子发挥功能的报道仅来自两个方面:Huang等研究发现在水稻中DST功能的缺失增加气孔关闭的程度,减少了叶片气孔的密度,从而提高水稻的耐盐性和抗干旱的能力,并认为这一过程是通过调控体内
H2O2的稳态而实现的(XinyuanHuang,DaiyinChao,JipingGao,,DST,regulatesdroughtandsalttoleranceinriceviastomatalaperturecontrol[J].GENES&DEVELOPMENT,2009,23:1805-1817)。Yuan等发现DST作为转录因子通过直接调控水稻体内细胞分裂素氧化酶基因0sCKX2的表达,影响内源细胞分裂素的合成,来增加水稻的结实率(ShuyuLi,BingranZhao,DingyangYuan,[J].PNAS,2013,110:3167-3172)。在其它方面的功能研究均未见报道。
【发明内容】
[0011]本发明目的是提供一种转录因子dst的新功能及新用途,即所述转录因子dst调控高温下植物结实率的用途以及所述转录因子dst调控提高植物抗高温能力的用途。
[0012]本发明提供了一种分离的转录因子dst基因,;其为一种锌指转录因子。本发明转录因子dst基因可以根据无性系突变体库中筛选得到。
[0013]本发明中,,其中,所述高同源性是指同源性>60%;较佳地,同源性>80%;更佳地,同源性
>90%或更高。
[0014]本发明还提出一种转录因子dst突变体的重组表达载体的构建方法,具体步骤为通过数据库中已报道的DST基因的序列设计引物,通过使用KOD高保真PCR酶克隆得到该基因全长(包括启动子区域)为3966bp,利用pCAMBIA1300构建该基因的回复表达载体,测序正确后将载体转化到农杆菌感受态中,通过农杆菌介导法将基因导入到突变体愈伤组织中,再通过抗生素的筛选、分化和鉴定获得转基因植株。观察花期高温处理下回复材料的结实率及发育状况,明确目的基因与耐高温表型的相关性。
[0015]本发明转录因子dst可作为在花期高温情况下的负调控因子,对高温胁迫起到负调控作用,其突变体在40°C15d的花期处理条件下结实率明显优于野生型,证明该基因在花期高温情况下可作为负调控因子,对高温胁迫起到负调控作用。
[0016]本发明还提出了转录因子dst在调控高温下植物结实率中的应用。所述植物为水稻。
[0017]本发明还提供了一种调控高温下植物结实率中的方法,分别选取突变体和野生型各300颗饱满的种子,破休眠诱导生芽生根后,在营养液中进行培养,在抽穗前一天进行380C,7d,40°C,7d和40°C,15d的高温处理,每个处理条件选取50个株系。处理结束后继续进行正常培养直至成熟,分别统计处理的和正常培养植株的首穗的结实率。其结实率比野生型分别高将近
10%、20%和30%。而在40°C15d的高温处理条件下野生型(ZHll)结实率为O。表明该突变体在高温胁迫条件下,在结实率方面具有明显的优势。
[0018]本发明还提出了转录因子dst在提高植物抗高温能力中的应用。所述植物为水稻。
[0019]本发明还提出了一种调控提高植物抗高温能力的方法,分别选取突变体和野生型各300颗饱满的种子,破休眠诱导生芽生根后,在营养液中培养到18天,高温(day/night:42/37°C,13h/llh;Rh30%)处理幼苗3天,然后移至正常培养条件下培养15天,统计结果发现突变体存活率明显高于野生型。
·[0020]本发明还提出一种所述转录因子dst的回复表达载体,该载体为pCAMBIA1300-dst。
[0021]本发明还提出了一种遗传工程化的宿主细胞,。
[0022]本发明有益效果包括:可以提高作物在高温胁迫条件下的结实率,并且可以提高植物对高温的耐受能力。本发明可应用于植物培育中,选育出具有特定品质性状的优良品种。本发明克隆得到调控水稻高温胁迫下结实率和提高植物耐高温能力的主效基因。本发明在农业领域特别是提高作物对高温的耐受性和提高作物结实率方面具有重要的应用前