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构建体的制作方法
本发明提供了一种构建体,其包含(i)编码酪氨酸羟化酶(TH)的核苷酸序列,(ii)编码GTP-环化水解酶I(CH1)的核苷酸序列和(iii)编码芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)的核苷酸序列,其中编码TH的核苷酸序列与编码CH1的核苷酸序列相连,使得它们编码融合蛋白TH-CH1。本发明还提供了包含所述核苷酸序列的病毒载体以及其在治疗和/或预防帕金森氏病中的用途。
【专利说明】构建体
发明领域
[0001]本发明涉及一种包含编码参与多巴***合成途径的酶活性的核苷酸序列的构建体。可操作地连接至少两条核苷酸序列使得它们编码一种融合蛋白。本发明也提供包含所述核苷酸序列的病毒载体基因组、载体生产系统和病毒载体颗粒。核苷酸序列在体内的表达,例如通过使用病毒载体颗粒的基因治疗,导致多巴***的合成,这在治疗和/或预防以产生多巴***的神经元的减少或损失为特征的神经系统疾病,如帕金森氏(Parkinson’sdisease)病中是有用的。
[0002]发明背景
[0003]帕金森氏病(PD)是一种神经变性疾病,其是以黑质区产多巴***的神经元的损失为特征的。这最终导致在纹状体中多巴***的耗竭,引起严重的运动障碍。帕金森氏病的一种治疗方法是口服给药
L-D0PA,即多巴***的前体,这可以恢复一定程度的运动功能。然而,随着病情的发展,在运动障碍的治疗中L-DOPA治疗变得不那么有效,需要使用更高的剂量,这具有严重的副作用。
[0004]可以通过将多巴***直接释放到纹状体来实现ro的改善治疗。这可以通过基因治疗来实现。基因治疗对于ro治疗是有吸引力的,因为特定蛋白质的产生可以靶向cns(中枢神经系统)的特定区域,如纹状体。从氨基酸酪氨酸的多巴***合成涉及酶酪氨酸羟化酶(TH),其催化从酪氨酸的L-DOPA合成,和芳香族氨基酸脱羧酶(AADC),其将L-DOPA转化为多巴***。TH步骤被认为是限速的。TH发挥功能需要辅因子四氢生物蝶呤(BH4),其合成是由酶GTP-环化水解酶I(CH-1)催化的。
[0005]在ro动物模型中,已经研究了使用腺伴随病毒(AAV)载体从多巴***生物合成途径递送单一基因的基因治疗方法具有一些行为益处(Leff等人,1999Neuroscience92,185-196;Bankiewicz等人,2006MolTherl4,564-570)。进一步的方法表明,在PD动物模型中同时递送两种或更多种介导多巴***合成的酶表现出更大的功效(Fan等人,1998HumGeneTher9,2527-2535.;Shen等人,2000HumGeneTherll,1509-1519.;Muramatsu等人,2002HumGeneTher13,345-354)
。
[0006]这导致了以下理论,如果所有三种多巴***合成酶共同并在同一细胞中表达,那么多巴***合成会更高,并会导致在ro中更有效。然而,由于AAV载体有限的包装能力,可以被递送的基因数量是有限的。因此,决定使用慢病毒载体(LV)用于此目的,因为这些载体的包装容量要大得多。因为它们稳定转导非分裂细胞类型,例如神经元的能力,慢病毒载体(LV)用于对中枢神经系统(CNS)的基因治疗方法是特别有利的。已经开发了衍生自非灵长类慢病毒的,尚未知道对于人类是感染性或病原性的LV,如马传染性贫血病毒(EIAV),而
且确定了其转导非分裂细胞的能力。PiOSmdn?是一种用于ro治疗的基于马传染性贫血病毒(EIAV)的lv。ProSavin?的基因组是三顺反子构建体,其包含由两个内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接的三种关键的多巴***合成酶,即TH、AADC和CHl的编码序列。目前ProSavinit正在Ι/II期临床试验中进行评估,其中使用在包括三种质粒瞬时共转染HEK293T细胞的流程中产生的载体材料(Mitrophanous等人,1999GeneTher6,1808-1818)。
[0007]任何基因治疗方法的一个目标是提高载体的滴度,从而能使用体积更小的载体制备物。这在PraSavinfc型治疗中是特别理想的结果,其中将所述载体直接注射到脑中,因此需要使用小体积。
[0008]IRES元件的复杂二级结构可能成为有效逆转录的阻碍。因此,本发明人假设IRES元件的去除应该增加载体的滴度。其中一个方案是以编码短肽序列(接头)的序列取代IRES元件以产生包含多巴***合成所需的三种酶活性中的两种或更多种的融合蛋白。然而,因为TH的天然形式以同源四聚体存在(Goodwill等人,1997NatStructBiol4,578-585),而CHl的天然形式以同源十聚体存在(Nar等人,1995Structure3,459-466;Steinmetz等人,1998JMolBiol279,189-199),这些酶彼此或与其它酶,如AADC的融合可能阻止了酶的正确的三级结构形成,然后这可能抑制酶的功能或阻止其以最大的能力发挥功能。支持这一点,先前已经报道,TH和β-半乳糖苷酶之间的融合是无酶活性的(Wu和C印ko(1994),JNeurochem62:863-72)。
[0009]令人惊奇的是,本发明人发现对于导致升高的L-DOPA和/或多巴***产生水平的一些构建体,两种或全部三种多巴***合成酶的融合导致i)功能性酶;和ii)增强的多巴***生物合成途径。特别的是,与使用具有以IRES序列分隔的编码多巴***合成酶的全部三种基因的构建体获得的水平相比时,对于一些构建体观察到增强的多巴***的产生。与预期相反,对于许多构建体,这些融合设计带来的改善与载体滴度的增加设査关联,表明IRES序列对滴度不具有抑制作用。此外,L-DOPA和多巴***升高的水平并不是由于来自融合设计载体的蛋白表达的增加引起的,表明融合设计具有更高的比活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1-编码多巴***酶融合体的基因组的示意图。
[0011]图2-pONYK-TAiC的载体产量和HEK293T细胞中整合的载体的儿茶酚***产量
[0012]a)DNA整合分析评估载体滴度的结果
[0013]b)HPLC分析评估儿茶酚***产量的结果。
[0014]图3-载体和儿茶酚***产量
[0015]a)DNA整合分析评估载体滴度的结果
[0016]b)HPLC分析评估HEK293T细胞中产量的结果。
[0017]图4-通过western印迹分析检测产多巴***通路中的蛋白。
[0018]图5-五个融合构建体的载体和儿茶酚***产量
[0019]a)DNA整合分析评估载体滴度的结果
[0020]b)HPLC分析评估HEK293T细胞中儿茶酚***产量的结果。
[0021]图6-通过western印迹分析检测产多巴***通路中的蛋白。
[0022]a)Western印迹分析检测TH的表达
[0023]b)Western印迹分析检测CHl的表达
[0024]c)Western印迹分析检测AADC的表达。
[0025]图7-显示TH的截短形式通过GS15接头与AADC连接的图。
[0026]图8-通过western印迹分析检测HEK293T转导细胞的产多巴***通路中的蛋白。[0027]a)Western印迹分析检测TH的表达
[0028]b)Western印迹分析检测CHl的表达
[0029]c)Western印迹分析检测AADC的表达。
[0030]*TH融合CHl的正确条带的大小为68kDa,而且虽然在这些泳道中可以看到条带,在这个大小在所有其它泳道中存在一条非特异性条带。然而,条带在强度上比非特异性条带更暗。
[0031]图9-DNA整合分析评估未浓缩和浓缩的融合载体制备物的载体滴度的结果。
[0032]图10-以MOIl用EIAV载体转导的纹状体神经元
[0033]a)经EIAV-GFP转导的纹状体神经元(MOIl)
[0034]b)经载体转导的纹状体神经元的儿茶酚***产量。
[0035]图1l-TCiAmod的载体产量和整合的载体的儿茶酚***产量
[0036]a)DNA整合分析评估载体滴度的结果
[0037]b)HPLC分析评估HEK293T细胞中儿茶酚***产量的结果。
[0038]图12-用pONYKl、融合体和GFP载体对人原代皮质神经元的转导
[0039]a)来自以M0I2和10用EIAV-GFP载体转导的人原代皮质神经元的图像
[0040]b)***产量(减去GFP背景水平)_收获1(转导后5天)。
[0041]图13-通过western印迹分析对经转导的***质神经元的多巴***合成酶的检测
[0042]a)Western印迹分析检测TH的表达
[0043]b)Western印迹分析检测AADC的表达。
[0044]图14-显示在第I天立体定位载体给药后的临床评价分数(最高14)的图。
[0045]图15-在基线(基线)、MPTP损伤后(MPTP),和最后0XB-102载体给药后3个月(MPTP3MPI)的猕猴脑的PET图像。在不同的时机用放射性示踪剂18F-FMT(18F_FMTyr)和18F-Fallypride(18F_FalIypride)治疗动物。
【发明内容】
[0046]本发明人已经测试了大量包含多巴***合成酶酪氨酸羟化酶(TH)、GTP-环化水解酶I(CHl)、芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)的构建体,所述构建体包含3种基因中的至少2种的融合体。
[0047]作为本研究的结果,出现了两个明显的主题:
[0048](i)具有以所述顺序连接(即形成TH-CHl融合蛋白)的
TH和CHl的构建体给出高的儿茶酚***产量绝对水平;及
[0049](ii)具有以任何顺序(即形成AADC-TH或TH-AADC融合蛋白)连接的AADC和TH的构建体给出L-DOPA到多巴***的高效转化。与这样的构建体相关的多巴***:L-DOPA的比值是较高的。
[0050]在本发明的第一方面的第一实施方案中,本发明提供一种构建体,其包含(i)编码酪氨酸羟化酶(TH)的核苷酸序列,(ii)编码GTP-环化水解酶I(CHl)的核苷酸序列和(iii)编码芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)的核苷酸序列,其中编码TH的核苷酸序列与编码CHl的核苷酸序列相连,使得它们编码融合蛋白TH-CHl。[0051]所述构建体可以选自如下:
[0052]TH-L-CHl-懼S_AADC;
[0053]AADC_l_TH_l_CH1;
[0054]TH_l_CH1_lJVADC;和
[0055]TH_l_CH1_pJVADC
[0056]L=接头编码序列
[0057]IRES=内部核糖体进入位点
[0058]P=启动子
[0059]所述构建体可以不包含启动TH-CHl融合蛋白翻译且在TH-CHl编码序列上游的IRES0
[0060]在本发明的第一方面的第二实施方式中,本发明提供一种构建体,其包含
(i)编码酪氨酸羟化酶(TH)的核苷酸序列,(ii)编码GTP-环化水解酶I(CHl)的核苷酸序列和
(iii)编码芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)的核苷酸序列,其中编码AADC的核苷酸序列可操作地与编码TH的核苷酸序列相连,使得它们编码AADC-TH或TH-AADC融合蛋白。
[0061]所述构建体可以选自如下:
[0062]TH_l_AADC_懼S—CH1
[0063]AADC_l_TH_勝CHl
[0064]AADC_l_TH1_l_CH1
[0065]TH1_l_AADC_l_CH1
[0066]L=接头编码序列[0067]IRES=内部核糖体进入位点
[0068]所述构建体可以包含不是为人类使用而密码子优化的接头。
[0069]所述构建体可以包含接头,。
[0070]所述构建体可以具有序列AADC_u_TH