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沙门氏菌检测
1设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
:2℃~5℃。
:36℃±1℃,42℃±1℃。
。
。
:。
:容量500ml,250ml。
:1ml()、10ml()或微量移液器及吸
头。
:直径90mm。
:3mm×50mm、10mm×75mm。
。
。
。
2培养基和试剂
(BPW):见附录中1。
(TTB)增菌液:见附录中2。
(SC)增菌液:见附录中3。
(BS)琼脂:见附录中4。
:见附录中5。
(XLD)琼脂:见附录中6。
。
(TSI)琼脂:见附录中7。
、靛基质试剂:见附录中8。
():见附录中9。
(KCN)培养基:见附录中10。
:见附录中11。:.
:见附录中12。
-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见附录中13。
:见附录中14。
:见附录中15。
。
。
3操作方法
、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管(1ml、
10ml)、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量,避免操作中出入操作间。
。
,关闭紫外杀菌灯,进入缓冲间,换工作鞋,用消毒
液洗手或用乙醇棉球擦手,穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。
、工作台面,再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、
袋等的开口处周围,待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。
称取25g(ml)样品放入盛有225mlBPW的无菌均质杯中,以8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mlBPW的无菌均质袋中,用拍击式
均质器拍打1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需测定pH
值,用1mol/±。无菌操作将样品转至500ml锥形
瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。如为冷冻产
品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1ml,转种于10mlTTB内,于42℃±1℃
培养18h~24h。同时,另取1ml,转种于10mlSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。
分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平
板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于36℃±1℃分别培养18h~
24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板)或40h~48h:.
(BS琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。
表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板沙门氏菌
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;
BS琼脂
有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。
蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心
HE琼脂
黑色或几乎全黑色。
菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中
XLD琼脂
心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。
沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。
,接种三糖铁琼脂,
先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培
养基和营养琼脂平板,于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖
铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。
表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断
斜面底层产气硫化氢
+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属
KA
KA+(-)+(-)-可疑沙门氏菌属
AA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属
AA+/-+/--非沙门氏菌
KK+/-+/-+/-非沙门氏菌
注:K:产碱,A:产酸,+:阳性,-:阴性;+(-)多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。
,可直接接种蛋白胨水
(供做靛基质试验)、尿素琼脂()、氰化钾(KCN)培养基,也可在初
步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h~24h,
必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温
至少保留24h,以备必要时复查。
表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应序
硫化氢(H2S)(KCN)赖氨酸脱羧酶
号
A1+---+
A2++--+
A3----+/-
注:+:阳性,-:阴性,+/-:阳性或阴性。:.
:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧
酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
(KCN)赖氨酸脱羧酶判定结果
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结
---
果)
沙门氏菌IV或V(要求符合本群生化特
-++
性)
沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结
+-+
果)
注:+:阳性,-:阴性。
:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项
试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶
阳性。甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
。
表5沙门氏菌属各生化群的鉴别
项目IIIIIIIVVVI
卫矛醇++--+-
山梨醇+++++-
水杨苷---+--
ONPG--+-+-
丙二酸盐-++---
KCN---++-
注:+:阳性,-:阴性。
,
判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬
液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
%~%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝
集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2%~3%)培养基上再检查;如果是由于
Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌
液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时,%~:.
%半固体琼脂平板的中央,俟菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或
%~%半固体琼脂的小玻管1次~2次,自远端取菌培养后
再检查。
(O)鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上
的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区
域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内
的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任
何程度的凝集现象皆为阳性反应。
(H)。
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(ml)样品中检出或未检
出沙门氏菌。
:.
附录培养基和试剂
1缓冲蛋白胨水(BPW)
磷酸氢二钠(含12个结晶水)
蒸馏水1000ml
±
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH,高
压灭菌121℃,15min。
2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
蒸馏水1000ml
±
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH,高
压灭菌121℃,20min。
硫代硫酸钠(含5个结晶水)
蒸馏水加至100ml
高压灭菌121℃,20min。
:.
蒸馏水加至100ml
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为
止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
%煌绿水溶液
蒸馏水100ml
溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。
蒸馏水100ml
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121℃,20min。
基础液900ml
硫代硫酸钠溶液100ml
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇
匀后再加入另一种成分。
3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
L-
蒸馏水1000ml
±
:.
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55℃
以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10ml(-胱氨酸,
加1mol/L氢氧化钠溶液15ml,使溶解,再加无菌蒸馏水至100ml即成,如为DL-
胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH。
4亚硫酸铋(BS)琼脂
~20g
蒸馏水1000ml
±
将前三种成分加入300ml蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠
分别加入20ml和30ml蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和
30ml蒸馏水中,琼脂加入600ml蒸馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至
80℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。将柠檬
酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH,随即倾入琼脂液中,
混合均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,
贮于室温暗处,超过48h会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
5HE琼脂(HektoenEntericAgar)
:.
~
蒸馏水1000ml
%
±
将前面七种成分溶解于400ml蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600ml
蒸馏水内。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。
再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择
性。
②甲液的配制
蒸馏水100ml
③乙液的配制
蒸馏水100ml
④Andrade指示剂
1mol/:.
蒸馏水100ml
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧
化钠溶液1ml~2ml。
6木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
L-
蒸馏水1000ml
±
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400ml蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。另
将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后,再加入指示
剂,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,
贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备,第二天使用。
7三糖铁(TSI)琼脂
:.
硫酸亚铁铵(含6个结晶水)
蒸馏水1000ml
±
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400ml蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。另
将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后,再加入指示
剂,混匀,分装试管,每管约2ml~4ml,高压灭菌121℃10min或115℃15min,
灭菌后置成高层斜面,呈桔红色。
8蛋白胨水、靛基质试剂
蛋白胨(或胰蛋白胨)
蒸馏水1000ml
±
将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH,分装小试管,121℃高压灭菌15min。
:将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸
25ml。
-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95%乙醇内。然后缓慢加入
浓盐酸20ml。
挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d~2d,必要时可培养4d~5d。加入
,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约:.
,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后
方可使用。
9尿素琼脂()
%
蒸馏水1000ml
20%尿素溶液100ml
±
除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入400ml蒸馏水中,煮沸溶解,调节
pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后,再
加入指示剂后分装,121℃高压灭菌15min。冷至50℃~55℃,加入经除菌过滤的
尿素溶液。尿素的最终浓度为2%。分装于无菌试管内,放成斜面备用。
挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h,观察结果。尿素酶阳性者由于产
碱而使培养基变为红色。
10氰化钾(KCN)培养基
蒸馏水1000ml:.
%
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后121℃高压灭菌
15min。放在冰箱内使其充分冷却。%
(最后浓度为1:10000),分装于无菌试管内,每管约4ml,立刻用无菌橡皮塞塞紧,
放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养
基,分装试管备用。
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾
(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1d~2d,
观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在
冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气
体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试验时对每一环
节都要特别注意。
11赖氨酸脱羧酶试验培养基
蒸馏水1000ml
%溴甲酚紫-
L-赖氨酸或DL-/100ml
±
除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100ml,分别加入赖氨酸。L-赖氨
%加入,DL-赖氨酸按1%加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸。分
装于无菌的小试管内,,上面滴加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。
:.
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36℃±1℃培养18h~24h,观察结果。氨基
酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产
酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
12糖发酵管
磷酸氢二钠(含12个结晶水)
%
蒸馏水1000ml
±
,调节pH。%加入葡萄糖,分装于
有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。
,分装每瓶100ml,121℃高压灭菌
15min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5ml糖溶液加入于
100ml培养基内,以无菌操作分装小试管。
注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36℃±1℃培养,一般2d~
3d。迟缓反应需观察14d~30d。
13ONPG培养基
邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)
()
1%蛋白胨水()
将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于无菌的小试
管内,,用橡皮塞塞紧。:.
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36℃±1℃培养1h~3h和24h观察结
果。如果β-半乳糖苷酶产生,则于1h~3h变黄色,如无此酶则24h不变色。
14半固体琼脂
~
蒸馏水100ml
±
按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直
立凝固备用。注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。
15丙二酸钠培养基
%
蒸馏水1000ml
±
除指示剂以外的成分溶解于水,调节pH,再加入指示剂,分装试管,121℃
高压灭菌15min。
:.
用新鲜的琼脂培养物接种,于36℃±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色
变为蓝色。