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〔一〕蛋白质测定方法的比较〔原理、优缺点〕
蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法〔Lowry法〕和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:〔1〕实验测定要求的灵敏度和精确度;〔2〕蛋白质的性质;〔3〕溶液中存在的干扰物质;〔4〕测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法〔Lowry法〕和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:〔1〕实验测定要求的灵敏度和精确度;〔2〕蛋白质的性质;〔3〕溶液中存在的干扰物质;〔4〕测定花费时间。
1微量凯氏定氮法〔-2023〕
。含氮有机物即分解产生氨〔消化〕,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤
,~,误差为±2%;操作复杂费时,整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。,测得结果为总氮含量,包括蛋白氮和非蛋白氮含量;适用范围广,几乎所有样品均可用此方法。
2双缩脲比色法
。因蛋白质含有两个以上的肽键,所以有双缩脲反响。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,在一定的实验条件下,未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反响,并于540~560nm测定,即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。
,即可测定。先绘制标准曲线,再测定样品
~20mg,20~30分钟操作简便、呈色稳定性好、试剂单一;测定结果与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关;灵敏度不高,约为1mg,双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
3福林酚法〔Lowry法〕
+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸复原,产生蓝色化合物,在一定条件下,利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。该化合物在750nm有最大吸收峰。
、乙液后可见光度计750nm测定;先绘制标准曲线、再测定样品。
,但试剂可长期保存;测定灵敏度高,约5mg,测定时间约40~60分钟,操作简便;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化〔测定结果受待测样品蛋白中肽键存在形式及含量的影响〕。
4紫外吸收法
,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收顶峰在280nm处,其吸光度〔即光密度值〕与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
,需绘制标准曲线
~100mg,5~10分钟完成,操作十分简便,但结果受样品蛋白品种影响大。
5考马斯亮蓝法
,蛋白质和染料结合符合比尔定律,因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
;先绘制标准曲线,再测定样品。
,约为1~5mg〔比Lowry法灵敏4倍〕,测定时间5~15分钟,操作简便、迅速、干扰物质少、重线性好,但要求样品颜色为无色或浅色,灵敏度高。
〔二〕蛋白含量的测定方法及步骤
1微量凯氏定氮法〔-2023〕
硫酸铜、硫酸钾、硫酸、2%硼酸溶液、混合指示液〔%%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合;%%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合〕、40%氢氧化钠溶液、。
消化架、吸量管、量筒、微量滴定装置、锥形瓶、容量瓶、定氮蒸馏装置
:
~2g,半固态2~5g,液体样品10~20mL〔约相当于30~40mg氮〕于枯燥洁净的凯氏烧瓶,参加6g无水K2SO4,,20mLH2SO4。瓶口放一小漏斗,先小火加热待泡沫停止后加大火〔330~400℃〕,直到溶液澄清透明,~1h。冷却后加水定容100mL〔数次冲洗,使样品溶液全部移入容量瓶〕
将2%硼酸溶液10mL放入100mL三角瓶中〔接收瓶〕,参加甲基红混和指示剂2~3滴,此时为紫红色,将冷凝管尖端浸入液面下。蒸馏装置中的水蒸气发生器装水2/3,参加数粒玻璃珠,加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
~,以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反响室内,随后塞紧棒状玻塞。,提起玻塞使其缓缓流入反响室,立即将玻塞盖紧,并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹,开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下蒸馏液接收瓶。
馏出液用标准HCl溶液滴定,直到蓝绿色变为淡紫色。并将滴定结果用空白试验校正。
:
蛋白质〔%〕=〔V1-V2〕×C××F×100/mV3×100%
V1—样品滴定时消耗的标准HCl溶液体积〔mL〕
V2—空白滴定时消耗的标准HCl溶液体积〔mL〕
C—标准HCl溶液的摩尔浓度〔mol/L〕
—1mL1mol/
F—氮换算成蛋白质的系数,
m—试样的质量〔g〕
V3—测定时吸取消化液的体积〔mL〕
2双缩脲法
 〔1〕标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白〔BSA〕或标准酪蛋白,配制成10mg/mL的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。%NaCl配制,。
 〔2〕双缩脲试剂:〔〕〔〕,用500mL水溶解,在搅拌下参加300mL10%NaOH溶液,用水稀释到1L,贮存于塑料瓶中〔或内壁涂以石蜡的瓶中〕。此试剂可长期保存。假设贮存瓶中有黑色沉淀出现,那么需要重新配制。
可见光分光光度计、试管15支、旋涡混合器等。
:取7支试管,分别参加0,,,,,,用水补足到1毫升,然后参加4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温〔20~25℃〕下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。以蛋白质的含量为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
图1双缩脲法测定蛋白质标准曲线
3福林酚法〔Lowry法〕
:50份A与1份B混合,即为试剂甲
A液:10gNa2CO3,〔〕。溶解于500mL蒸馏水中。
B液:〔CuSO4•5H2O〕溶解于100mL蒸馏水中。
:
在2L磨口回流瓶中,参加100g钨酸钠〔Na2WO4•2H2O〕,25g钼酸钠〔Na2MoO4•2H2O〕及700mL蒸馏水,再加50mL85%磷酸,100mL浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,参加150g硫酸锂〔Li2SO4〕,50mL蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色〔如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤〕。稀释至1L,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水
1倍,使最终的酸浓度为1mol/L左右。
〔250µg/mL〕:精确称取结晶牛血清清蛋白,溶于蒸馏水再定容。
可见光分光光度计、旋涡混合器、秒表、试管
:取7支大试管,分别参加0,,,,,,〔浓度为250µg/mL〕。,然后每支试管参加5mL试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温〔20~25℃〕放置10分钟。,同样立即混匀。这一步混合速度要快,否那么会使显色程度减弱。然后在室温下放置10分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于750nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制出标准曲线。
图2福林酚法测定蛋白质标准曲线
4紫外吸收法
取八只试管分别参加0ml、、、、、、、4mL的1mg/mL牛血清蛋白标准溶液,加水至4mL,在280nm条件下测定其吸光值
图3紫外法测定蛋白质标准曲线
5考马斯亮蓝法
:。
:取10mL牛血清蛋白标准储藏液加水定容至100mL
:-250溶于50mL95%乙醇,,作为母液保存,使用时用水稀释到1000mL。
试管、移液管、移液枪、可见分光光度计
取六只试管分别参加0mL、、、、、µg/mL牛血清清蛋白标准液,。-250试剂,摇匀放置5min,在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标,牛血清清蛋白的浓度〔μg/mL〕为横坐标绘制标准曲线。
图4考马斯亮蓝法测定蛋白质标准曲线