新型嵌合α-淀粉酶变体的制作方法.docx

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专利名称::新型嵌合α-淀粉酶变体的制作方法
技术领域:
:本申请主要涉及用于工业过程的α-淀粉酶,例如用于液化、烘焙和清洗应用。更具体地说,本申请涉及在高温应用中活性改善和/或提供改善的淀粉降解性能的嵌合α-淀粉酶。
背景技术:
:对于许多使用淀粉的工业过程,希望具有可在高温下起作用以快速分解淀粉从而降低粘度的淀粉分解酶。这种酶的实例是本领域中已知的。例如,来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶,分别为AmyL和AmyS,其利于在高温下淀粉的液化。在不加入钙的情况下,AmyL以及AmyL的变体具有比AmyS淀粉酶更高的热稳定性,因此优选用于葡萄糖和果糖的生产(例如HFCS)。AmyS以及AmyS的变体在乙醇产生过程中是优选的,因为它们在高温下具有比AmyL或其变体更高的对玉米淀粉的比活。因此,AmyS具有更快速的底物粘度降低初始速度,其在淀粉液化过程中是非常想要的属性。但是,AmyS具有不希望的特性,其催化活性导致在过程结束时比AmyL或其变体高的最终粘度。更高的最终粘度可能是低热稳定性的结果,即AmyS更快被液化过程的高温仅仅简单失活。已经研究了增加酶热稳定性的方法。通过缺失
AmyL序列中不存在的两个氨基酸R176-Glyl77(相对于AmyQ的氨基酸序列计数)增加AmyQ(解淀粉芽孢杆菌()淀粉酶)的热稳定性,如Suzuki等人(I989)()所示。可通过缺失来自环(F178至A184)的两个氨基酸R179-G180(AmyS计数)增加AmyS类型淀粉酶的热稳定性,如Igarashi等人1998()所示。但是,具有此缺失的突变AmyS酶具有比亲代酶低的高温下玉米淀粉水解比活,使得AmyS淀粉酶的主要优点之一不再存在,如Shiau等人(2003)()所示。如上所述,本领域中已知,在不加入钙的情况下,野生型AmyL淀粉酶比AmyS淀粉酶热稳定性更好。本领域中还已知,AmyQ,来自解淀粉芽孢杆菌的与AmyS和AmyL均高度同源的α-淀粉酶,比AmyS或AmyL热稳定性的差。Suzuki等人(1989)证明了,对于AmyL-AmyQ来源的杂化物,需要AmyL酶的N端部分以获得高稳定性。
发明内容本文提供了优选由AmyL和AmySα-淀粉酶制成的嵌合多肽。该新嵌合淀粉酶是有用的,因为单个酶提供了比AmyL类型淀粉酶中可见的相对更高的热稳定性,以及比AmyS类型淀粉酶中可见的相对更高的比活。因此,本文提供了改进的淀粉酶,其提供了改变的性能特征,例如在液化的高温条件下降低粘度的能力方面。如一般由
AmyS类型淀粉酶观察到的,该嵌合淀粉酶显示比活提高或者提供淀粉液化中峰值粘度快速降低的能力。另外,嵌合α-淀粉酶具有良好的热稳定性,因此可提供如通常在AmyL类型酶中所见的低最终粘度。本文提供了热稳定性提高的多肽、比活增加的热稳定淀粉酶以及包含该多肽和酶的组合物,和使用该新型酶或组合物的方法。本文还提供了编码该嵌合酶的核酸,包括表达载体,以及表达该嵌合淀粉酶的宿主细胞。嵌合α-淀粉酶提供了以下益处,单个嵌合酶可提供两个独立的酶中所提供的许多优点。本文所述的嵌合淀粉酶的利用可为制造商带来生产利益,并且为最终用户和制造商都带来经济效益。嵌合α-淀粉酶特别可用于乙醇生产过程以及其他高温下的淀粉降解过程,例如糖浆生产或者发酵的液化过程、清洗应用(例如清洗、洗涤)、烘焙或者纺织材料的脱浆。该酶是相对热稳定的,并且在ρΗ条件、钙离子浓度和氧化还原条件的大范围内具有良好的活性。在一个方面中,本文提供了包含氨基端结构域和羧基端结构域的嵌合多肽。该氨基端结构域包含AmyL淀粉酶的约180个或更多连续氨基酸残基。优选地,该氨基端部分包含AmyL淀粉酶的N端部分。该嵌合多肽的羧基端结构域包括AmyS淀粉酶的羧基端部分。该嵌合多肽具有约480-515个氨基酸残基的全长。本文提供的嵌合多肽没有AmyL淀粉酶或AmyS淀粉酶的一级氨基酸序列,也不具有任何其他已知多肽的一级氨基酸
序列。该嵌合多肽相对于至少AmyS淀粉酶具有提高的热稳定性。在一些实施方案中观察到相当于或甚至好于AmyL的热稳定性。在另一个方面中,提供了热稳定嵌合α-淀粉酶。嵌合淀粉酶包含N端部分和C端部分;该N端部分包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列。该嵌合淀粉酶的C端部分包含来自AmyS淀粉酶C端的连续氨基酸序列。嵌合α-淀粉酶通常具有高于AmyL淀粉酶的比活。该嵌合淀粉酶还具有高于AmyS淀粉酶的95°C下的热稳定性。该嵌合淀粉酶的一级氨基酸序列约为475-520个氨基酸残基长。本文提供了包含一种或多种如上所述嵌合多肽或热稳定嵌合α-淀粉酶的组合物,或其组合。该组合物还可包含一种或多种另外的多肽或酶。还提供了包含该组合物的食品级冻干组合物。在另一个方面中,提供了编码如上所述嵌合多肽或热稳定α-淀粉酶的多核苷酸,包含该多核苷酸的载体以及包含该载体或多核苷酸的宿主细胞。在一个实施方案中,该多核苷酸编码与SEQIDNO1-17中的任意序列具有至少约95%序列同一性但是不具有SEQIDNO1或2的确切序列的多肽。还提供了制备和使用本文公开的嵌合多肽、热稳定α-淀粉酶以及组合物的方法。本文提供的方法考虑了与其一起使用一种或多种其他酶的可能性,包括一种或多种其他的淀粉酶。在一个方面中,提供了产生包含嵌合多肽或热稳定的α-淀粉酶的组合物的方法。该方法包括利用选自下列的宿主细胞用于表达蛋白质的发酵过程地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌
()和嗜热脂肪芽孢杆菌,所述蛋白质包含(a)长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽,并且含有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域,还含有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域,该嵌合多肽具有相对于至少AmyS淀粉酶提高的热稳定性,或者(b)长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶,并且含有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分,还含有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分,所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95°C下的热稳定性。该方法需要至少部分纯化表达的蛋白质,以产生该组合物。提供了液化淀粉浆(starchslurry)的方法,其包括制备包含淀粉的浆液,将该浆液加热至液化可接受的温度,向该浆液中添加包含本文所提供的一种或多种嵌合多肽或热稳定嵌合α-淀粉酶或其组合的组合物。在足以将淀粉浆液化的温度下和时间段内将该浆液与组合物一起孵育,来完成此方法。该方法可用作生产燃料酒精方法的一部分。还提供了清洗表面以去除不希望的或不想要的淀粉残渣的方法。该方法包括以下步骤提供具有待去除淀粉残渣的表面,在足以导致淀粉残渣去除的温度下和时间段内将该表面与包含本文公开的嵌合多肽、热稳定嵌合
α-淀粉酶或其组合的组合物相接触。还提供了处理纺织材料的方法,该纺织材料之前已经与包含淀粉或淀粉衍生物的涂层相接触。该方法包括在足以从该纺织材料基本上去除该涂层的时间段内和条件下,将该纺织材料与包含如上所述的嵌合α-淀粉酶的液体相接触。还提供了利于淀粉浆液液化的试剂盒,所述试剂盒包含下列至少之一(a)长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽,并且含有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域,和含有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域,该嵌合多肽具有相对于至少AmyS对照提高的热稳定性,或者(b)长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶,并且含有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分,和含有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分,所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95°C下的热稳定性。该试剂盒还包含该试剂盒用于淀粉浆液化的使用说明书。图1是用于表达多种杂交体和淀粉酶的质粒图。质粒元件如下Bla,编码氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性标记的β内酰***酶基因;AprE启动子区域,来自枯草芽孢杆菌AprE(碱性蛋白酶)的启动子,其具有与芽孢杆菌宿主染色体同源的区域,允许其整合进宿主基因组;AprE肽,枯草芽孢杆菌AprE信号序列;Hybrid186,目的基因编码区域,例如杂化物
186;LATTerm,来自地衣芽孢杆菌的天然淀粉酶LAT(热稳定的衣芽孢杆菌淀粉酶,Iicheniformisamylasethermostable)终止子;CAT,用于***霉素抗生素抗性的***霉素乙酰转移酶基因;ORL用于大肠杆菌()的复制起点。注意,该质粒缺乏用于芽孢杆菌属的复制起点。图2显示与对照,AmyS对照相比在95°C下的热稳定性筛选中嵌合α-淀粉酶性能的结果。该嵌合α“淀粉酶包含来自AmyL的氨基端部分和来自AmyS的羧基端部分。所测试的嵌合体包括186、187、200、202、228、249、254和259。用于本文嵌合α-淀粉酶名称中的三位数字显示AmyL序列最后一个氨基酸残基的位置,嵌合体的剩余部分来源于AmyS序列。所用的对照酶(“AmyS对照”)(SEQIDNO3)是具有R179-G180缺失的变体AmyS[描述于W02005/111203]。将酶保持于要求的温度下(95V),在测定所示的时间点移开样品。,(分钟,X轴)的相对剩余催化活性(百分比,Y轴),其使用MEGAZYMECERALPHA合成寡糖底物,如本文所述。孵育条件和测定的详细说明在方法部分提供。图3显示其他嵌合α-淀粉酶在95°C下的热稳定性。图2中的图显示随着时间(分钟,X轴)的淀粉酶活性剩余(百分比,Y轴)。反应条件与图1相同。所测试的嵌合体包括200SB、202SB和228SB。本文中使用的
“SB”表示通过引入S187D和S188T突变产生稳定用盐桥。对照是AmyS对照(SEQIDNO3)。图4显示其他嵌合α-淀粉酶在95°C下的热稳定性。该图如图2和3。反应条件与图2和3中相同。所测试的样品包括AmyS对照,以及嵌合体249SB、254SB和259SB。图5显示几种嵌合α-淀粉酶在75°C下的比活。如下所述(细节参见方法部分),使用DNS还原糖检测测定来确定嵌合体186、228和228SB相比于AmyL和AmyS对照酶的反应速率。比活记录为反应中每秒每mg酶产生的mg葡萄糖。所测的所有三种嵌合酶显示在所测试的高温75°C下高于AmyL酶的比活。图6显示在与多种杂交体淀粉酶一起孵育后玉米淀粉底物粘度的变化。比较杂交体186、202SB、228SB和228与AmyS对照降低粘度的能力,如具有扭矩读数输出的EUROSTAR/IKALabortechnikcontrol-viscP7电子顶部搅拌器所测。图7,A-E图,显示SEQIDl至17的氨基酸序列。氨基酸序列标记对于所有杂化物氨基酸序列,AmyL序列以普通文本显示,AmyS序列区域以黑体显示,盐桥序列以下划线显示。图8,A-I图,显示SEQID18至34的核苷酸序列。核苷酸序列标记对于所有杂化物核苷酸序列,AmyL序列以普通文本显示,AmyS序列区域以黑体显示,盐桥序列以下划线显示。发明详述提供了相比现有的α淀粉酶具有有益优点的嵌合α淀粉酶。该嵌合α-淀粉酶包含来自AmyL淀粉酶的N
端部分和来自AmyS淀粉酶的C端部分。该嵌合α-淀粉酶显示相对于AmyS酶提高的热稳定性,以及相对于AmyL酶提高的比活或或降低峰值粘度的能力。因此,这些性能使得该嵌合多肽和热稳定淀粉酶可用于高温淀粉液化,例如发酵产品例如醇,尤其乙醇的生产。它们导致相对于单独使用的AmyL淀粉酶峰值粘度降低,以及相对于单独使用的AmyS淀粉酶降低的最终粘度。本文提供的嵌合酶还可用于在其他高温过程例如烘焙中分解或去除淀粉、淀粉酶、支链淀粉或α-淀粉酶的其他底物,以及在纺织材料处理中用以去除基于淀粉的胶粘剂,或者用于清洁/洗涤过程。本文提供的嵌合酶还可彼此和/或与一种或多种其他酶联合使用,例如在混合物中。优选地,所用的其他酶在与嵌合α-淀粉酶所用的相同或类似反应条件下有活性。这为最终用户提供了更大的灵活性,以及某些经济和处理的优点。可建立允许α-淀粉酶和任何其他所存在的酶有活性的处理条件,例如ρΗ、温度、离子强度以及所需辅因子的存在。这些处理条件可利于使用连续或半连续过程,而不是昂贵且耗时的分批过程。嵌合α-淀粉酶的某些实施方案中所提供的其他特征有比活增加,以及降低淀粉浆的峰值粘度或最终粘度的能力,其等同或优于AmyL和AmyS酶。。应当指出如本文中所用,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓,除非上下文另外清楚地说明。因此,例如,对
“一种酶”的提及包括多种此类酶,并且对“该制剂”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种制剂和其等同物的提及等。有关数值或范围的术语“约”表示数值可以高于或低于所示值的10%。在另一些实施方案中,“约”表示数值可以高于或低于所示值的5%。本领域技术人员会了解术语“约”在与氨基酸残基或碱基对的个数或范围,或者以氨基酸残基表示的多肽长度,或者以碱基对表示的多核苷酸长度一起使用时,仅涵盖整数值。除非另外定义,本文中所用的全部技术及科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同意义。下文提供了以下术语。“淀粉酶”表示能够催化淀粉、直链淀粉、支链淀粉等降解等等的酶。一般来说,α-淀粉酶(;α_D_(1—4)-葡聚糖的葡聚糖水解酶)定义为内切作用酶,其切割含有三个或更多个α-D-(1—4)连接的葡萄糖单元的多糖中的α-D-(1—4)O-糖苷键。α-淀粉酶释放α-构型的还原基团。它们以随机形式作用于淀粉、糖原和相关的多糖和寡糖。相反,外切作用淀粉分解酶从非还原端依次切割底物分子。葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(麦芽糖α-淀粉酶;)产生α-麦芽糖作为终产物,而β-淀粉酶()产生β-麦芽糖。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(;α-D-葡萄糖的葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(;α_D_(1—4)-葡聚糖葡糖水解酶)以及产物特异性淀粉酶可从其各自的底物产生特定长度的麦芽