文档介绍：该【抗坏血酸在诱导多能干细胞制备和胚胎干细胞培养的应用的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【24】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【抗坏血酸在诱导多能干细胞制备和胚胎干细胞培养的应用的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。抗坏血酸在诱导多能干细胞制备和胚胎干细胞培养的应用的制作方法
专利名称::抗坏血酸在诱导多能干细胞制备和胚胎干细胞培养的应用的制作方法
技术领域:
:本法明涉及再生医学研究领域,特别涉及改进诱导多能干细胞的制备方法以及改善胚胎干细胞的培养方法及其应用。二,
背景技术:
:胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)来自晡乳动物早期胚胎的内细胞团,在体外培养中能够在t]我更新(self-renewal)的同时保持多能性(pluripotency〉和向不同组织细胞分化。1981年随着小鼠胚胎干细胞的首次分离成功(EvansandKaufman,1981;Martin,1981),胚胎干细胞研究拉开序幕。直到1998年,人的胚胎千细胞得到分离和建立(),标志着再生医学研究的真正开始。随后多年的研究集中在两大方面,一是研究胚胎干细胞在自我更新的同时保持多能行的分子机理,同时不断完善不同物种的胚胎干细胞的培养以及建立新的哺乳动物胚胎千细胞;二是建立胚胎干细胞向特定组织细胞的分化方法并研究分化的分子机理。前一方面的标志性事件包括,以Nanog-0ct4-Sox2转录因子为核心的调控网络的阐明(Jongh画
Kim2008;XiChen2008);LIF(HitoshiNiwa1998)/BMP4(QiLongYing2003)/FGF4(TiloKunath2007)信号传导通路的阐明,并因此发现小鼠胚胎干细胞的基态(groundstate)培养方法(QilongYingetal,2008)。后一方面,利用小鼠和人胚胎干细胞进行的分化研究已经在包括神经细胞,心肌细胞,胰岛细胞,血细胞等多种体外分化过程中得到成功结果,与此同时,也建立了这些分化过程的成熟方法和分子检测标准,同时大大推动了胚胎干细胞或成体千细胞分化的分子机理研究。以上两个方面的研究相对独立但又相辅相成。在以小鼠胚胎千细胞为核心材料的机理和应用研究快速进展的同时,如何获得作为再生医学研究的关键材料一人胚胎干细胞,尤其是来自病人自身的胚胎干细胞一直以来都面临着巨大的技术困难和伦理争议。直到2006年,日本京都大学Ya腿naka研究小组在小鼠中初步实现了诱导重编程过程。他们采用体外基闪转染技术,从24个因子中筛选出0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子,通过逆转录病毒将上述4个转录冈子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞,在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbxl5+的多潜能干细胞系,该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小KES细胞非常相似,而在基因表达谱、DNA***化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞,故将其命名为诱导的多能性干细胞
(inducedpluripotentstemceil,iPScell)(TakahashiK2006)。次年,同一个实验室进一步用Nanog代替Fbxi5进行筛选,得到了Nanog+的iPS细胞系,该iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达、移植到小鼠皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似,而且在DNA***化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。此外,研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因;而转染的上述4个基因在iPS细胞中并没有表达,表明这些基因只在诱导过程中起作用,iPS细胞保持多潜能性状态的原因是内源性转录因子,如Nanog等基因的表达(0kitaK2007)。同时,来自美国科学家的研究工作同样证实了上述4个转录因子足以使小鼠成纤维细胞在体外诱导重编程为类似小鼠ES细胞的iPS细胞(WernigM2007)。基于同样或类似的思路,同年(2007年)晚些时候,人的iPS细胞建立获得成功(TakahashiK2007;YuJ2007)。随后的研究进一步利用人类皮肤活检组织中提取的体细胞成功诱导为iPS细胞(ParkIH2008),这充分证明了利用这种方法制备患者特异性的干细胞是可行的,因而有望克服细胞异体移植治疗中存在的免疫排斥反应以及避免传统方法带来的伦理争议。在最近一年的研究工作中,围绕iPS的两大根本问题,即效率低下和安全问题,已经在不断取得突破。虽然有利用非整合型质粒或蛋白质进行重编程的报道
(YuJ2009;ZhouH2009),然而归根结底,iPS的效率低下始终对于其发展和应用都将是巨大的障碍。与此类似,胚胎千细胞的体外长期稳定的培养,不仅是一个关键技术问题,同时又是一个重要的基础研究领域。如何建立一个成分明确并尽量简单,易于操作的胚胎干细胞培养基和培养方法,一直以来都备受关注。因此,本发明提供了利用抗坏血酸或其衍生物进行体细胞诱导重编程以及胚胎干细胞培养的方法。三,
发明内容共两部分内容,第一部分,为了提高产生小鼠和人iPS细胞的效率,本发明提供了利用抗坏血酸或其衍生物作为主要添加成分用于产生iPS细胞的具体方法以及应用。具体方法包括以下步骤(1)将一个或多个干细胞多能性W子导入体细胞;(2)用本发明提到的添加抗坏血酸或其衍生物的胚胎干细胞培养基,培养(1)中经导入的体细胞,将体细胞诱导重编程为iPS细胞;(3)利用内源报告基因激活表达或形态观察初步确定(2)中形成克隆的状态;(4)挑出符合(3)条件的单克隆,即内源报告基因激活或克隆呈现胚胎干细胞在相同培养基中生长的形态;(5)利用含有抗坏血酸的胚胎干细胞培养基培养(4)中的单克隆细胞;(6)利用多种检测手段,鉴定(5)中单克隆细胞的状态是否达到类似胚胎下细胞的状态,主要包括定量PCR分析干细胞特异基因表达,分析体内自发分化形成畸胎瘤的能力,对于非人iPS细胞,检测嵌合能力,是否有生殖细胞转移
(germlinetransmission^涉及利用抗坏血酸或其衍生物为主要添加剂高效产生iPS的应用有两个方面,一,研究iPS形成的分子机理;二,筛选新的能够显著改变iPS进程的化合物或因子。第二部分,为了改善小鼠和人胚胎干细胞的体外连续培养,本发明提供了利用抗坏血酸或其衍生物作为主要添加成分用于小鼠,猴和人胚胎干细胞的培养方法以及应用。当前标准的胚胎干细胞培养方法,主要有两大类。对于使用血清的胚胎干细胞培养基,如小鼠和猴胚胎干细胞的培养基,简单地额外添加抗坏血酸可以显著改善胚胎干细胞的自我更新状态;对r无血清胚胎干细胞培养基,目前国际较公认的培养基有使ffl血清替代物(KSR)或其他多种添加成分(如TeSR)的胚胎干细胞培养基,这些培养基已经含有抗坏血酸,无须额外添加;但对于其他类型即将开发的无血清干细胞培养基,添加抗坏血酸有利于胚胎干细胞的自我更新状态和多能性维持。因此本发明第二部分内容针对范畴是以血清为主要成分的胚胎干细胞培养基以及不含KSR或TeSR的其他新型无血清培养基。涉及利用抗坏血酸或其衍生物为主要添加剂改善胚胎干细胞的自我更新状态的应用有两个方面,一,研究胚胎干细胞维持自我更新和多能性的分子机理;二,筛选新的能够显著影响胚胎干细胞自我更新禾I多能性的化合物或因子。四,图1,VC显著提高0G2小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的诱导重编程效率。在以血清为基础的小鼠
iPS实验中,与其他抗氧化剂(维生素Bl,VB1;N-乙酰半胱S:酸,NAC;还原型谷胱甘肽,Gmee;亚硒酸钠,Sel)相比,VC显著提高经典四因子SKOM(Sox2,0ct4,Klf4和cMyc)和三因子SK0(Sox2,0ct4和Klf4)的iPS效率(iPS效率以流式细胞仪分别检测四因子第9天以及三因子第16天转基因0ct4启动子驱动的GFP基H表达效率)。图2,用添加有VC的血清胚胎干细胞培养基制备的iPS克隆具有与胚胎干细胞相似的多能性。(A)用mES+乂(:培养基制备的不同小鼠13克隆细胞内源胚胎干细胞标记基因的表达用实时定量?0检测结果与小鼠胚胎干细胞系Rl基本一致;(B)不同小鼠iPS克隆细胞胚胎干细胞标记基因Nanog启动子***化水平检测结果丄jRl—致,显著低于iPS初始细胞MEF(黑色实心圈代表该位点***化,空心圈代表去***化);(C)这些iPS克隆细胞具有多能性,分别体现在在裸鼠畸胎瘤实验中能够形成内(腺体),中(骨骼),外胚层(皮肤)细胞,以及形成嵌合小鼠(蓝色胚胎来自0G2小鼠的lacZ转基因染色)。图3,其他抗坏血酸衍生物对小鼠iPS的影响。与对照相比,抗坏血酸(LM),稳定型衍生物抗坏血酸磷酸酯(ASCP)均能显著提高四因子和三因子iPS效率,但是氧化型抗坏血酸(DHA)则对iPS无显著影响。图4,VC促进iPS前体细胞(pre-iPScells)向完全iPS细胞(full-iPScells)的转变。(A)MEFiPS前体细胞C2,C4和C5用含有VC
的培养基处理9代后GFP阳性率显著提高,而对照组不加VC的GFP阳性率持续很低;(B)C2和C4加VC处理后的克隆形态和GFP荧光情况比较相同代数的未处理对照细胞更加接近mES细胞。图5,VC有利TiPS细胞维持自我更新状态。。(A)iPS细胞在含VC培养基中能更好的维持0ct4-GFP的表达;(B)iPS细胞在含VC培养基中能更好维持胚胎干细胞形态和GFP克隆比例。图6,WJ添加有VC的培养基制备的人iPS细胞形态人ESC没有明显区别。(A)人成体细胞形态(B,C)以VC为主耍添加剂制备的人iPS克隆AP染色及形态图;(D)人iPS克隆在无滋养层培养的形态图。图7,用添加有VC的培养基制备的iPS的效率比较其他经典或己报道的培养基显著提高。在图示中的二次独立实验中,以AP染色阳性克隆数为指标(纵坐标)衡量不同培养基,包括单纯血清(DFBS),血清加以VC为主的抗氧化剂(DFBS+A),单纯血清替代物(KSR),以及血清加丙戊酸(VPA),结果显示,DFBS+A得到的AP阳性iPS效率显著高于其他培养基,值得注意的是,该组合甚至高于目前国际己报道的显著提高人iPS效率的VPA。图8,含有VC的培养基用于细胞因子对小鼠iPS效率影响的筛选。相比经典的mES培养基,添加以VC为主的抗氧化剂(A)培养基更有利于细胞因子对iPS影响的筛选。具体体现在在mES中没有显著差异的bFGF在mES+A中显著提高iPS效率。五,具体实施方案定义和技术除非另外指明,本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组
DNA的传统技术,其属于本领域技术范围。参见例如,Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆实验指南,第3版(2002);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY((1987));丛书METHODSINENZYM0L0GY(AcademicPress,Inc.):■PCR2:APRACTICALAPPROACH(,,,(1995)),Harlow和Lane编著,(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUALandANIMALCELLCULTURE(,(1987));,HANDBOOKOFSTEMCELLS,巻2。除非另外说明,本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义,为了便于理解本发明,将本文中使用的一些术语进行了下述定义。在说明书和权利要求书中使用的,单数型"一个",和"这个"包括复数参考,除非上下文另有清楚的表述。例如,术语"(一个)细胞"包括复数的细胞,包括其混合物。所有的数字标识,例如pH、温度、时间、浓度和分子量,包括范围,都是近似值。要了解,虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语"约"。也要了解,虽然不总是明确的叙述,本文中描述的试剂仅仅是示例,其等价物是本领域已知的。本文所述的抗坏血酸添加到培养基中的浓度在lug/ml—200ug/ml范围内。本文所述的"抗坏血酸衍生物"是指结构类似抗坏血酸,具有抗氧化活性的类似化合物。这些化合物在保持抗坏血酸生物活性的同时,具有更加稳定或更加易于被细胞吸收的特征。本文所述的
"诱导的多能性干细胞(iPS细胞)"是这样的细胞,其来源是体细胞通过诱导体细胞重编程的干细胞多能性因于体外诱导变化而成,其在ES细胞培养条件下,与ES细胞在细胞形态、生长特性、衷面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似,而且在DNA***化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞儿乎完全相似。本文中所用的术语"体细胞"是相对于"生殖细胞"以及"胚胎干细胞"而言的概念,其是由"胚胎干细胞"分化产生的不再具有多能性,而是具有某一具体功能的细胞,其是由"胚胎干细胞"分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性,一般具有具体功能的细胞,其一般从发育阶段位于囊胚期()之后的胎鼠或成鼠取材,取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞等)。本文中所用的体细胞优选来源于哺乳动物,更优选来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠,最优选地,来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞,优选为成纤维细胞或脑膜细胞。本文所述的"诱导体细胞重编程的干细胞多能性冈子"为对于干细胞多能性维持关键的W子,通过向体细胞中导入所述因子可以在一定条件下诱导体细胞重编程为胚胎干细胞。迄今为止众多文献已经报道了多个可以用于重编程的这样的因子,参见例如
Qin,D.,Li,W.,Zhang,J.&Pei,-likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsby0ct4/Sox2/Myc/,959-962(2007)、Okita,K.,Ichisaka,T.&Yamanaka,-,313-317(2007)、Wernig,-cell-,318-324(2007)、Y咖anaka,-^柳CWi1,39-49(2007)等等。本领域技术人员已知多种可以用于这样的干细胞多能性因子。优选地,所述的多能性因子包括0ct4、Sox2(任选地,Soxl)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc),以及K丄f4(任选地,Klf5或Klf2)、Esrrb、Nanog、以及Lin28。上述多能性因子可以根据所要导入的细胞而是任何来源的,优选为小鼠的多能性因子以及其变体,如Sox2,(小鼠包含SRY-框的基因2);0ct4,NCBI登录号为NM—(小鼠POU结构域,5类,转录因子