文档介绍：淀粉酶米氏常数的测定
一、目的要求
了解底物浓度与酶反应速度之间的关系,学习和掌握米氏常数(Km)及最大反
应速度(Vm)的测定原理和方法,测出淀粉酶在以对淀粉为底物时的Km 和
Vm值。
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
其中[S]Vm为最大反应速度;Km 为米氏常数。
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。
特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时,米氏常数Km往往可以反映出酶与
各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm,可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作
图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式,即:
以1/v对1/[S]作图,可得一条直线,所得直线的截距是1/Vm,斜率为Km/ Vm。通过Lineweaver-Burk作图法作图后可方便的求出Km值。
三实验材料、仪器和试剂

淀粉酶购自国药集团医药有限公司。(以大约2000 U/g计),先用少量40℃蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml容量瓶内,沉淀再加水捣研。如此重复,最后全部移入容量瓶中,定容后摇匀,用四层纱布过滤,滤液供测试定用。

比色管,试管25 mm×200 mm,平头移液管(可用磨去尖头的2mL移液管制);刻度吸管5mI—(X1),移液管20 mI;秒表,吸耳球(×1),电热恒温水浴锅,721型分光光度计。

(1)原碘浓称取碘11 g,碘化钾(KI)22 g,先用少量蒸馏水使碘—碘化钾完全溶解,定容至500 mL,贮于棕色瓶内。
(2)稀碘液取原碘液2mL,加碘化钾20 g,用蒸馏水定容至500 。
(3)4%(),用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL,加热煮沸至透明,冷却后定容至100 mL, 此溶液现配现用。
(4) pH —柠檬酸缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 12H2O)(C6H8O7〃H2O),用蒸馏水溶解定容至1000 mI用酸度计或pH试纸校正pH。
(5) HCl
取36%盐酸(饱和浓盐酸)
量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。

1. 淀粉浓度梯度标准曲线的制作
2. Km测定
在不同底物(可溶性淀粉)浓度(%、%、%、%、%、%、%、%)的反应体系中60℃反应5min,测定酶的反应速度V(以单位时间内吸光度的减少量dA/dt来表示),以1/v-v[s]的双倒数法作图,计算Km值。在比色管中加入不同底物(可溶性淀粉)浓度(%、%、%、%、%、