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专利名称::微生物制备3-羟基异丁酸的制作方法微生物制备3-羟基异丁酸本发明涉及相对于其野生型经基因技术改变的细胞,制备经基因技术改变的细胞的方法,通过这些方法可得到的经基因技术改变的细胞,制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯的方法,制备***丙烯酸或***丙烯酸酯的方法,和制备聚曱基丙烯酸或聚曱基丙烯酸酯的方法。本发明另外涉及经分离的DNA、载体、该载体用于转化细胞的用途、转化的细胞和多肽。***丙烯酸(尤其是以其烷基酯的形式)是一种用于制备聚合产物的重要中间体。众所周知的曱基丙烯酸衍生物是例如曱基丙烯酸的曱基酯。目前***丙烯酸甲酯的全球年产量是约150万吨。聚***丙烯酸酯是塑料领域具有多种用途的粗原料。通常通过在作为催化剂的固体多金属氧化物物料上C厂碳化合物(例如丁烯、异丁烯、丁烷、异丁烷、叔丁醇或异丁烯酪)的异相两步催化的气相氧化反应商业化生产***丙烯酸。所得到的产物气体混合物(其除了曱基丙烯酸以外,也含有大量次级产物)随即进行全缩合反应而产生曱基丙烯酸水溶液,或吸纳在适宜的溶剂混合物中。通常随后通过蒸馏、结晶、萃取或这些措施的组合,进一步纯化所得到的液相。除了Cr碳化合物的催化气相氧化反应以外,***丙烯酸也可以通过催化氧化脱氢反应由异丁酸制备,如例如在EP-A-0356315
中所述。制备曱基丙烯酸的另一种可能是所谓的"ACH方法",其中使2-曱基-2-羟基丙***和疏酸反应,生成异丁烯酰***作为中间体,它然后进一步与水反应生成曱基丙烯酸。所得到的***丙烯酸随即通过蒸馏进行纯化。该方法描述在例如EP-A-1359137中。这些制备***丙烯酸的常规方法的缺点尤其是,在曱基丙烯酸本身的制备过程中和在包含蒸馏纯化的后续步骤中,由于***丙烯酸的高聚合反应倾向,通过热负荷性方法步骤导致二聚体或寡聚体的生成;这不仅造成额外的纯化工作,而且造成产率损失。本发明的任务是克服现有技术的缺点。更具体地,本发明的任务是,提供制备曱基丙烯酸的方法,其可以用尽可能小的热负荷性步骤获得***丙烯酸。基丙烯酸成为可能。完成上述任务的一个贡献由相对于其野生型经基因技术改变的细胞提供,所述细胞与其野生型相比能生成更多的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯,但是优选生成更多的3-羟基异丁酸,该生成优选通过作为前体的***丙二酸半醛或通过3-羟基异丁酰-辅酶A而进行。如果3-羟基异丁酸或基于3-幾基异丁酸的聚羟基烷酸酯通过作为前体的***丙二酸半醛生成,更优选的是生成通过作为进一步中间体的琥珀酰-辅酶A、丙酰-辅酶A或丙烯酰-辅酶A、特别优选通过琥珀酰-辅酶A而进行。在3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯通过作为前体的3-羟基异丁酰-辅酶A生成的情况下,更优选地生成通过作为进一步中间体的异丁酰
-辅酶A或通过3-羟基丁酰-辅酶A、优选通过3-羟基丁酰-辅酶A而进行。在此使用的术语"前体,,定义了可以仅在一个反应步骤中以酶促途径转化成3-羟基异丁酸的化学化合物,而术语"中间体"定义了不能仅在一个反应步骤中以酶促途径转化成3-幾基异丁酸的化学化合物。在此使用的术语"3-幾基异丁酸"始终描述对应的C广羧酸,其在通过相应微生物的生成之后以依赖于pH-值的形式存在。由此,该术语始终包含纯酸形式(3-羟基异丁酸)、纯碱形式(3-幾基异丁酸)以及酸的质子化和去质子化形式的混合物。此外,术语"3-羟基异丁酸"原则上包含(R)和(S)立体异构体,其中(S)立体异构体是特别优选的。措辞"与其野生型相比能生成更多的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯"也适用于下述情况经基因技术改变的细胞的野生型根本不能生成任何3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯,至少没有可检测量的这些化合物,并且仅能在经基因技术改变后生成可检测量的这些组分。细胞的"野生型"优选指其基因组以天然地通过进化而产生的状态存在的细胞。该术语用于完整细胞和单个基因。因此,术语"野生型"不具体地涵盖其基因序列已经至少部分地通过重组方法人工改变的那些细胞或那些基因。由3-羟基异丁酸可以随即通过温和的脱水化反应而获得曱基丙烯酸。在基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯的情况下,可以分离在细胞中包含的装有这种聚羟基烷酸酯的嚢泡,并随即分解聚合物以产生
3-羟基异丁酸,其然后可以脱水而获得曱基丙烯酸。在此根据本发明优选的是,经基因技术改变的细胞如下地经基因技术改变,即使它在确定的时间间隔内、优选在2小时内、更优选在8小时内、最优选在24小时内,生成比该细胞的野生型多至少2倍、特别优选至少10倍、更优选至少100倍、更优选至少IOOO倍和最优选至少10000倍的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯。在此产物生成的增加可以例如如下测定,即在相同条件下(相同的细胞密度,相同的营养培养基,相同的培养条件)于适宜的营养培养基中分别分开地培养根据本发明的细胞和野生型细胞特定的时间间隔,并且随即测定营养培养基中的目标产物(3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基烷酸酯)的量。根据本发明的细胞可以是原核或真核细胞。在此可以涉及哺乳动物细胞(例如,人源细胞)、植物细胞或微生物如酵母、真菌或细菌,其中^t生物是特别优选的,且细菌和酵母是最优选的。特别合适地用作为细菌、酵母或真菌的是保藏在德国Braunschweig的DeutscheSa隨lungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)的那些细菌、酵母或真菌菌抹。根据本发明适宜的细菌属于在,根据本发明适宜的酵母属于在
,根据本发明适宜的真菌是在。根据本发明特别优选的细胞是下述属的细胞举炎^***^广Co/y/ze6a"eW"迈人避并脔/^f"re7/'6a"er/w迈入fy^并^"虞("勘c/"ws入不动奸霧虞^」c//2e^a"er入#乙凝Yf霧虞举赤發母^if户/c力/a人fiT/wero/z7/ces人綍#^广i^cc力aro迈/ces入埃#《霧^f^c力er/c力/a入发發#應霧^广一,脂,、孕A發#脔/)ifK37"/w/a、f差奸霧^,,力身銜霧^(^a/Wo//a人潔卓^霧^("尸"i/fl^770/2^人俗^i,^潜A霧^4(^wir力o/(/eWaj和嫂炎'^"^^f***虞(T/oWr/c^'咖义其中斧悉返Yf霧(^re「/6a"er/w迈/7a7咖人/乙发'發短^f霹(^re"'6a"eW咖/a"o/"er/z7e/"/z7乂义應軒霧ri"5"c力eWc力/aco//人"歸力a層/cescerm'"'se人#乙凝^#维#母m瞎層/ces/ac〃s人布直^^潔A發母"a72cr油Wa由./人誕為"教^踭母("Cai2cT/d/aru^w人谷,凝棒炎Yf^"("Coiy/ze6a"eWi/迈^(^Cor"e6a"er/w/z7e/Y7c/e/75^、运动发餘在應f^并豚6^力//(62"^^^64:549-554(1989)),pEKExl(Eikmanns等人,"el07:69-74(1991))或pHS2-1(Sonnen等人,C107:69-74(1991)),是基于隐蔽性质粒pHM1519,pBLl或pGAl。也可以以相同方式使用其它质粒载体,例如基于pCG4(US4,
489,160)或pNG2{Serwold-Davis等人,尸fy^Ze〃er"6:119-124(1990)}或pAGl(US5,158,891)的那些。其它适宜的质粒载体是,在它们的辅助下可以应用通过整合入染色体来扩增基因的方法的那些质粒载体,例如Reinscheid等人U卯7/ecra/Kf^^/ro//ze/7"/#/cro6/o/o#760:126—132(1994))关于复制或扩增hom-thrB操纵子已经描述的那些。在该方法中,将整个基因克隆进能在宿主(通常是大肠杆菌)中复制、但是不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的质粒载体中。适宜的载体是,例如pSUP301(Simon等人,飾〃e由o7柳1:784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schafer等人,Ce/7el45:69-73(1994)),pGEM-T(PromegaCorporation,Madison,Wisconsin,USA),-T0P0(Sh飄n,/o訓a/o"/o/og/ca/C力e/z/2'"/y269:32678-84(1994)),pCRBlunt(Invitrogen,Groningen,Niederlande),pEMl(Schrumpf等人,/ow"a/o尸勘"er/o/o^j173:4510-4516))或pBGS8(Spratt等人,Ge"e41:337-342(1986))。随后通过缀合或转化,将含有待扩增的基因的质粒载体转入希望的谷氨酸棒状杆菌菌林。缀合方法描述在例如Schafer等人,jp;7//^/a"cT胁/濯腳"/60:756-759(1994)中。转化方法描述在琥珀酰-辅酶A)增加细胞中琥珀酰-辅酶A的供应的情况下,细胞中还原等价物的供应也定向地增加。增加还原等价物的一种可能由增加氧化性戊糖磷酸途径组成。与此相关地特别是增加葡萄糖
-6-磷酸脱氢酶()和/或优选由gnd基因编码的6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶()的活性,并任选地同时抑制糖酵解,例如通过降低葡萄糖-6-磷酸异构酶的活性,如WO-A-01/07626所述。除了戊糖磷酸途径的定向促进以外,或作为替代,进一步优选的是提供还原等价物,这通过给细胞供应乙醇作为碳源、借助醇脱氬酶(,,)促进细胞中乙醇向乙醛的转化、并借助乙醛脱氢酶()将乙醛进一步转化成乙酰辅酶A。另外,醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的适宜的基因可以参见技术人员已知的基因数据库,例如KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库。从草酰乙酸到琥珀酰-辅酶A的第二个途径通过作为中间体的柠檬酸进行。在该情况下,根据本发明的细胞的上述第一个、第二个或第三个替代方案的第二个特别实施形式,优选地该细胞任选地除了增加的酶Ei。或En的活性以外,还具有与其野生型相比增加的至少一种下述酶E13至Ew和Em至E26的活性(参见图8):-酶E^其催化草酰乙酸转化成柠檬酸;-酶E^其催化种檬酸转化成异柠檬酸;-酶Em其催化异柠檬酸转化成乙醛酸和琥珀酸;-酶Ew,其催化乙醛酸转化成苹果酸;-酶Em其催化苹果酸转化成延胡索酸;-酶Em其催化延胡索酸转化成琥珀酸;-酶Em其催化琥珀酸转化成琥珀酰-辅酶A。根据本发明特别优选的细胞在此是其中增加了下述酶或酶组合的活性的那些
E、E14、E15、E16、E24、E25、E26、E13E14、E13E15、E13E16、E13E24、E13E25、Ei3E26、E14E15、Ei4Ei6、EuE24、E14E25、Ei4E26、E15Ei6、E"E24、E"E25、E15E26^13E14E15E16E24E25E26,其中EuEwE^E』24E25E26是最优选的。与此相关地特别优选的是所述酶Eu是延胡索酸水合酶(),EH是琥珀酸脱氢酶()或琥珀酸醌氧化还原酶(),E"是琥珀酸辅酶A连接酶(),E"是柠檬酸合酶(),E24是乌头酸水合酶(),E"是异柠檬酸裂合酶(),和E26是苹果酸合酶()。酶Eu至E,6的优选基因是在前与从草酰乙酸到琥珀酰-辅酶A的第一个途径相关地已经描述的那些。酶E24优选由选自下纟且的基因编石马acol,aco2,ratireb,dme卜CG4706,dmel-CG4900,dmel-cg6342,cg9244,,,,adl032Wp,afr629wp,acnA,acnB,acnC,acnDrpfA,acnAl,acnA2,acnM,citB,leuC,cgl1540,sacA,can和aco,其中acnA和acnB基因是特别优选的。,icll,icl2,adl066cp,agl057wp,aceA,icl,aceAa,aceAb,cgl0097和cgl2331,其中aceA是特别优选的。根据一个特别实施形式,优选的基因是编码在基因水平或蛋白水平上失调的异柠檬酸裂合酶的基因。酶EM优选由选自下组的基因编码
,mlsSl,acr268cp,masAglcB,aceB,mls,glcB—1,glcB-2,cgl2329,masZ,aceBl,aceB2和mas,其中aceB基因是特别优选的。酶E24至E26的适宜的基因的核苷酸序列可以参见KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库。当通过增加酶E^或Eu的活性促进草酰乙酸从磷酸烯醇***酸或***酸的供应时,在异柠檬酸裂合酶分解异柠檬酸后生成的琥珀酸(除了乙醛酸以外)也可以用于生成琥珀酰-辅酶A。此外,在从草酰乙酸到琥珀酸的所述第二途径中可以有利地是降低酶E27的活性,其催化异柠檬酸转化成2-***戊二酸,且优选为异柠檬酸脱氢酶()。优选的是异柠檬酸脱氬酶为由选自下组的基因编码的酶固,idh2,cg7176,cg7176,cg7176,,,,idpl,idp2,idp3,aal022Wp,aer061Cp,idhC,idhM,icdA,icd,idh,icdl,icd2,leuB,citC,citC,cgl0664,leuB2,idh3A,idg3B,idh3G,cgl2233,dme卜CG5028,dmel-CG6439,,f23E丄180,,,adl223wp和afrl37cp,其中icdA和citC基因是特别优选的。从草酰乙酸到琥珀酰-辅酶A的第三个途径通过作为中间体的2-***戊二酸进行。在该情况下,根据本发明的细胞的上述第一个、第二个或第三个替代方案的第三个特别实施形式,优选地该细胞任选地除了增加的酶E,。或En的活性以外,还具有与其野生型相比增加的至少一种下述酶￡16、E24、E"
和E28的活性(参见图9):-酶Ew,其催化草酰乙酸转化成柠檬酸;-酵Em,其催化柠檬酸转化成异柠檬酸;-酶E",其催化异柠檬酸转化成2-***戊二酸;-酶E^其催化2-***戊二酸转化成琥珀酰-辅酶A。根据本发明特别优选的细胞在此是其中增加了下述酶或酶组合的活性的那些E"、E24、E27、E2s、Ei6Em、Ei6E27、E"E28、E24E27、E24E28、E27E28、Ei6E24E27、Ei6E24E28、E24E27E28和Ei6E24E27E28,其中Ei6E24E27E28是最优选的。与此相关地特别优选的是所述酶Eu是柠檬酸合酶(),E"是乌头酸水合酶(),E27是异柠檬酸脱氢酶(),和丑28是2-***戊二酸合酶()。酶Ew、E^和E27的优选基因是在前与从草酰乙酸到琥珀酰-辅酶A的第一个和第二个途径相关地已经描述的那些。酶E28优选由选自下组的基因编码korA,korB,korD,korAl,korA2:korBl,korB2,oorA,oorB,oorC,oorD,oforA,oforB,porA,porB,porAl,porA2,porA3,porA4,porG,porGl,porG2,porBl,porB2,porB3,,,,,korG,orA,orB,korGl和korG2。此外,E^也可以为由多个具有不同酶活性的亚基组成的脱氢酶复合物。更具体地,可以为包含***戊二酸脱氢酶()、二氬硫辛酰脱氢酶()和二氢硫辛酰赖氨酸-残基琥珀酰转移酶()的脱氢酶复合物。***戊二酸脱氢酶