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专利名称:磷酸二酯酶8a的制作方法
技术领域:
总的来说,本发明涉及命名为PDE8A的磷酸二酯酶的一个家族以及其应用。
背景技术:
磷酸二酯酶(PDEs)水解3′,5′环核苷酸生成它们各自的5′单磷酸核苷酸。环核苷酸cAMP和cGMP分别由腺苷酰和鸟苷酰环化酶合成,并作为许多细胞信号通路中的第二信使。第二信使信号的持续时间和强度是环核苷酸合成速率和分解速率的函数。
已鉴定了PDEs的各个家族。命名系统包括表示PDE家族的第一个数。到目前为止,已知7个家族(PDE1-7),它们通过(i)一级结构;(ii)底物优选性;(iii)对不同调节剂的反应,(iv)对特异抑制剂的敏感性;和(v)调节方式来分类[Loughney和Ferguson,关于磷酸二酯酶抑制剂,Schudt,等(编辑),学术出版社纽约,纽约(1996)-19]。表示家族的数后面是表示不同基因的大写字母,大写字母后面的第二个数,表示特异剪接变异体或使用独特转录起始位点的特异转录子。
到目前已鉴定的所有哺乳PDEs的氨基酸序列。包括位于蛋白羧基端一半的大约270个氨基酸的高度保守区域
[Charbonneau等,美国国家科学院院刊(美国)839308-9312(1986)]。保守结构域包括cAMP和/或cGMP水解的催化位点和两个推定的锌结合位点以及家族特异的决定簇[Beavo,生理评论75725-748(1995);Francis等,生物化学杂志26922477-22480(1994)]。各种PDEs的氨基端区域是高度可变的,包括其它家族特异决定簇例如(i)钙调蛋白结合位点(PDE1);(ii)非催化环GMP结合位点(PDE2、PDE5、PDE6);(iii)膜靶向位点(PDE4);(iv)疏水的膜相关位点(PDE3);和(v)对钙调蛋白-依赖的激酶II(PDE1)、cAMP-依赖的激酶(PDE1、PDE3、PDE4)或者cGMP依赖的激酶(PDE5)的磷酸化位点[Beavo,生理评论75725-748(1995);-13(1995);Conti等,生理评论75723-748(1995)]。
钙-钙调蛋白可以激活PDE1家族的许多成员。已鉴定三个基因PDE1A和PPE1B优选水解cGMP而PDE1C已表明对cAMP和cGMP都有高度亲和力。PDE2家庭特征是可以特异地由cGMP活化[Loughney和Ferguson,同上]。已经鉴定只有一个基因,PDE2A,其酶产物可以由红-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)特异抑制。PDE3家族中的酶类被cGMP特异性抑制。已知两个基因,PDE3A和PDE3B,对cAMP和cGMP都有高度亲和力,尽管对cGMP水解的Vmax足够低,以至cGMP作为cAMP水解的竞争抑制剂。甲***吡***和依诺西***特异抑制PDE3酶
[Loughney和Ferguson,同上]。PDE4家族影响cAMP水解,并包括4个基因,PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D,每一个都有多个剪接变异体。抗-抑郁的药环戊氧基甲氧苯基吡咯烷***特异抑制这个家族的成员。PDE5家族的成员在非催化位点结合cGMP,并优先水解cGMP。只有一个基因,PDE5A得到鉴定。光感受器PDE6酶特异水解cGMP[Loughney和Ferguson,同上]。除了伴有三个较小蛋白以形成锥部的PDE的PDE6C,基因包括PDE6A和PDE6B(其蛋白产物二聚体化并结合两拷贝的较小γ抑制亚单位以形成杆部的PDE。PDE7家族影响cAMP水解,但与PDE4家族相比较,不受环戊氧基甲氧苯基吡咯烷***抑制[Loughney和Ferguson,同上]。只有一个基因,PDE7A,已得到鉴定。
已知cAMP和cGMP在细胞内第二信使信号中的重要性,因而本领域存在持续的需要以鉴定另外的PDE种类。至今PDEs未知家族以及其基因和剪接变异体的鉴定将提供另外的药理学途径,以治疗环核苷酸途径异常的病态以及在某些细胞类型中想要调节细胞内cAMP和/或cGMP水平的病态。
发明简述简而言之,本发明提供命名为PDE8的新PDE家族的多肽和其多核苷酸。本发明包括自然发生的和非自然发生的PDE8多核苷酸和其多肽产物。自然发生的PDE8产物包括PDE8家族内的不同基因和多肽的种类(即PDE8A);这些种类包括在相同动物细胞内表达的以及在其它动物细胞内表达的对应种的同系物。在每一个
PDE8种类中,发明进一步提供由相同多核苷酸编码的剪接变异体,但它们产生于不同的mRNA转录子(即PDE8A1和PDE8A2)。非自然发生的PDE8产物包括自然发生产物的变异体如类似物(即其中一个或更多个的氨基酸得到添加、置换或删除)以及包括共价修饰(即融合蛋白、糖基化变异体、Met-1PDE8s、Met-2Lys-1-PDE8s、Gly-1PDE8s等等)的那些PDE8产物。PDE8家族不同于以前已知的PDE家族,对cAMP和cFMP的水解都表现高亲和,但对其它家族特异的酶抑制剂有相对低的敏感性。在优选的实施方案中,本发明提供了包含如SEQIDNO1中所陈述序列的多核苷酸。本发明也包括编码如SEQIDNO2中所陈述氨基酸序列的多核苷酸。本发明目前优选的多肽包括如SEQIDNO2中所陈述的氨基酸序列。本发明提供两个剪接变异体cDNA,它产生两个命名为PDE8A1和PDE8A2的多肽。PDE8A1和PDE8A2多肽以及编码多肽的多核苷酸,在此处作为本发明所包括的PDE8酶家族的代表讨论。
本发明提供编码人PDE8s的新纯化和分离的多核苷酸(如DNA序列和包括其剪接变异体的RNA转录子、正义和互补反义链)。本发明的DNA序列包括基因组和cDNA序列以及全部或部分化学合成的DNA序列。如此处所用的“合成的”,在本领域理解为是指与酶学方法相反的用于合成多核苷酸的纯化学方法。“全部”合成的DNA序列因而完全由化学方法合成,而
“部分”合成的DNAs包括那些其中只有部分DNA由化学方法合成。编码人PDE8多肽的优选DNA序列如SEQIDNO1中所陈述。也优选的是编码SEQIDNO2的PDE8多肽的多核苷酸以及SEQIDNOS6和4中分别陈述的PDE8A1和PDE8A2的剪接变异体多肽。编码PDE8A1和PDE8A2的优选多核苷酸,分别在SEQIDNOs5和3中陈述。本发明进一步包括种,优选人PDE8DNA的哺乳类同系物。
本发明也包括在适度严格条件下与SEQIDNOs1、3和5中多核苷酸的非编码链或互补杂交的编码PDE8种的DNA序列。本发明考虑能杂交但遗传密码多余的编码PDE8A多肽的DNA序列。典型的适度杂交条件如下在65℃、3×SSC、%,并在65℃%SDS的2×SSC中洗涤。在本领域中应该理解通过如Ausebel等(主编),分子生物学方法,JohnWiley&Sons(1994);。
根据探针鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)碱基对的长度和百分率可以经验确定或精确计算修约杂交条件中。如Sambrook等(主编),分子克隆实验室手册,冷泉港实验室出版社冷泉港,纽约(1989),。
也提供自动复制重组表达构建物如带有PDE8序列的质粒和病毒DNA载体。也提供表达构建物,其中PDE8-编码多核苷酸与内源或外源表达控制
DNA序列和转录终止子可操作性连接。
根据本发明的另一方面,也提供宿主细胞,包括用本发明的DNA序列以允许本发明PDE8多肽,稳定或瞬时转化表达的方式的原核和真核细胞。本发明的宿主细胞是免疫原有价值的来源用于发展特异地与PDE8免疫反应的抗体。本发明的宿主细胞在大量合成PDE8多肽的方法中也明显是有用的,其中细胞生长在合适的培养基中,所要的多肽产物从细胞或从细胞生长的培养基中通过例如免疫亲和纯化来分离。
PDE8DNA序列的知识允许修饰细胞从允许或增加内源PDE8的表达。通过用全部或部分异源启动子全部或部分置换自然发生的PDE8启动子修饰细胞(如通过同源重组)以提供增高的PDE8表达,以便细胞在高水平表达PDE8。异源启动子以此方式插入以便它与PDE8编码序列可操作连接。见例如PCT国际申请号WO94/12650、PCT国际申请号WO92/20808和PCT国际申请号91/09955。本发明也考虑除了异源启动子DNA之外,可扩增的标记DNA(如编码磷酸甲氨酰合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和氨甲酰天冬氨酸脱水酶的ada、dhfr和多功能CAD基因)和/或内含子DNA也可以与异源启动子DNA一起插入。如果与PDE8编码序列连接在一起,通过标准选择方法的标记DNA的扩增会在细胞中产生PDE8编码序列的共扩增。
本发明提供的DNA序列信息也使得通过如同源重组或“敲除”
策略[Capecchi,科学2441288-1292(1989)]发展成为可能,该策略是得到不能表达功能PDE8或表达PDE8变异体的动物。这样的动物作为研究PDE8体内活性和PDE8调节剂的模型是有用的。
本发明也提供纯化的和分离的哺乳类PDE8多肽。目前优选的PDE8A多肽陈述于SEQIDNOs4和6中。最优选的是含有陈述于SEQIDNO2中的氨基酸序列的PDE8多肽。本发明的PDE8多肽可以从天然细胞来源中分离或化学合成,但优选通过包括本发明宿主细胞的重组方法来合成。哺乳类宿主细胞的使用期望提供这些翻译后修饰(如糖基化、截短、脂质化和磷酸化),需要这些修饰以便对本发明的重组表达产物赋于最佳生物活性。本发明的PDE8产物可以是全长多肽、生物活性片段或保留特异的PDE8生物活性的其变异体。变异体可以包括PDE8多肽类似物,其中删除或置换一个或多个特异的(即自然编码)的氨基酸,或者其中加入一个或多个非特异的氨基酸(1)不丢失对PDE8特异的一个或多个生物活性或免疫特征;或者(2)PDE特定生物活性的特异残失。
本发明的变异体产物包括成熟的PDE8A产物,即其中去除前导或信号序列的PDE8产物,具有附加的氨基端残基。考虑在-1位具有附加甲硫氨酸残基的PDE8产物(Met-1-PDE8),以及在-2和-1位具有附加的甲硫氨酸和赖氨酸的PDE8产物(Met-2-Lys-1-PDE8)。这些类型的变异体,对在细菌细胞类型中重组蛋白合成尤其有用。
本发明也包括具有附加氨基酸残基的PDE8变异体,这些氨基酸残基产生于特异表达系统。例如使用商业可获得载体表达所需要多肽如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物的所需多肽,该多肽在-1位具有附加甘氨酸残基,结果能从所需多肽上切除GST成分。也考虑在其它载体系统中表达所产生的变异体。
本发明进一步包括修饰以包括一个或多个水溶多聚体附着物的PDE8产物。尤其优选的是和具有聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰的PDE8产物。水溶多聚体可以在特定位置如PDE8产物的氨基末端键合,或随机附着在多肽的一个或多个侧链上。
本发明也包括抗体(如单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体等等)和对PDE8产物或其片段特异的其它结合蛋白。使用分离或重组的PDE8产物、PDE8变异体或表达这些产物的细胞发展特异结合蛋白。使用已知的免疫方法,结合蛋白对纯化PDE8产物和在流体和组织样品中检测或定量PDE8产物是有用的。结合蛋白在调节(即阻断、抑制或激活)PDE8的生物活性,尤其是参与信号转导的那些活性是明显有用的。也考虑对抗-PDE8抗体特异的抗-独特型抗体。
通过本发明DNA和氨基酸序列的披露所贡献的信息的科学价值是明显的。鉴于一系列的实施例,
PED8AcDNA序列的了解使得通过使用Southern杂交或聚合酶链反应(PCR)鉴定编码PDE8以及PDE8表达控制调节序列如启动子、操纵子、增强子、抑制子等等的基因组DNA序列成为可能。在适度至高度严格的条件下用本发明的DNA序列进行的DNA/DNA杂交过程也预期允许分离编码PDE8A等位变异体的DNAs,本领域已知等位变异体包括对PDE8A特异的一个或多个生物和/或免疫特性的结构相关蛋白。相似地,编码与PDE8A同源蛋白的非人类种基因,也可以通过Southern和/或PCR分析得到鉴定。因为一个可选择的、互补研究对鉴定其它人PDE8产物以及享有一个或多个PDE8A生物特性的非人类蛋白和编码蛋白的DNA是有用。
本发明的多核苷酸,在用以检测细胞表达PDE8能力的杂交实验中也是有用的。本发明的多核苷酸也是用于鉴定PDE8位点中遗传改变的诊断方法的基础,而PDE8位点中遗传改变是造成疾病状态的根本原因。
本发明也可以得到的是识别并与编码PDE8的多核苷酸杂交的反义多核苷酸。提供全长和片段反义多核苷酸。反义多核苷酸通过表达PDE8mRNA的那些细胞对调节PDE8的表达尤其相关。
本发明提供的DNA和氨基酸序列信息也使得系统分析PDE8s的结构和功能成为可能。PDE8的DNA和氨基酸序列信息也允许鉴定与
PDE8A相互作用的分子。通过将推定的调节剂与PDE8温育并确定推定调节剂对PDE8磷酸二酯酶活性的影响可以鉴定调节(即增加、降低或阻断)PDE8活性的药剂。通过将它对PDE8的活性与它对其它PDE酶活性相比较,可以评估调节PDE8活性的化合物的选择性。本发明考虑以细胞为基础的方法,如双杂交实验和断裂杂交实验以及体外方法,包括固定多肽或它的结合伙伴的实验和溶液实验。
选择性调节剂可以包括如抗体和其它与PDE8或PDE8核酸特异结合的蛋白或肽、与PDE8或PDE8核酸特异结合的寡核苷酸、以及与PDE8或编码PDE8的核酸特异反应的其它非肽化合物(如分离的或合成的有机分子)。本发明也考虑影响野生型PDE8酶活性或细胞定位的PDE8突变形式。目前用于发展选择性调节剂的优选目标包括(1)和其它蛋白联系和/或细胞内定位PDE8的PDE8区域,(2)结合底物的PDE8区域,(3)PDE8的变构环核苷酸结合位点,(4)PDE8的磷酸化位点和(5)参与PDE8亚单位多聚化的PDE8区域。PDE8活性的调节剂对治疗已知PDE活性参与的广泛的疾病和生理状态是治疗上有用的。
本发明进一步考虑PDE8A酶活性的小分子调节剂。至少有三种不同类型的文库用以鉴定小分子调节剂。这包括(1)化学制剂文库、(2)天然产物文库和(3)包含随机肽、寡核苷酸或有机分子的组合文库。