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专利名称:用于鉴定、扩增和去除成体干细胞和癌干细胞的方法
用于鉴定、扩增和去除成体干细胞和癌干细胞的方法本发明涉及生物化学、药学和肿瘤学领域。本发明特别地涉及新的干细胞标志物用于分离干细胞的用途。本发明还涉及获得的干细胞和它们在例如,研究或治疗中的用途,例如用于制备治疗受损或患病组织的药物中的用途。本发明还涉及适合癌症治疗、并且更具体地适合癌干细胞治疗的方法。成体干细胞(综述于1中)在成年人和成年小鼠的许多器官(如果不是全部)中发现了成体干细胞。尽管不同的组织中成体干细胞的确切特征有相当大的变化,但是成体干细胞共有下述特征它们保持未分化的表型;它们的后代能够向相关组织中存在的全部谱系分化;它们在整个生命周期中保持自维持(self-maintenance)的能力;以及它们能够在损伤后再生相关的组织。干细胞位于特定的位置,即干细胞小生境(niche)。所述小生境通常提供合适的细胞-细胞接触和信号以维持“干性(sternness)”。某些组织表现出高水平的稳态更新。良好的实例是造血系统、皮肤和肠上皮。假定在这类组织中的干细胞不断地促进自我更新过程。在稳态条件下,诸如脑、心肌或骨骼肌的其它组织表现出非常少的增殖活性,如果有的话。这类组织中的干细胞很可能是休眠的,
并且只在失去分化的细胞时变得有活性,例如,损伤时。骨髓干细胞在过去的30年里一直是大量研究的主题。对其它成体干细胞的研究最近才有代表性地开始。有限数目的成体干细胞研究取得了不错的进展,即,表皮干细胞、毛囊干细胞、神经元干细胞和乳腺干细胞。在引人注目的实证中,显示了单个乳腺干细胞在导入乳腺脂肪垫时再生了全部乳腺上皮(2)。干细胞的研究有两个先决条件1)必须可能识别和分离活的原代干细胞。特异性标志物(其组合)的可用性是必需的。如在人和小鼠骨髓的初期研究所示例的,细胞表面标志物的组合允许分选强富集的细胞群体。2)体外细胞培养或体内移植测定随后允许证明全部分化的细胞类型的长期增殖。通常,根据这些测定系统,再分离并连续地测定干细胞来证明长期的干性和自我更新。作为成体干细胞的非限制性实例,更详细地讨论了肠干细胞。肠干细胞肠上皮是成体中最快速地自我更新的组织。少数干细胞被认为位于每个肠隐窝的基底处以确保连续和无限的更新。与其它快速自我更新的组织相比,肠干细胞是相当令人困惑的。没有关于这些细胞的离体或移植测定,肠干细胞的全部知识源自隐窝的原位组织学分析。肠干细胞比填充隐窝上部位置的它们的增殖后代分裂得更慢。尽管有结肠干细胞位于隐窝底部的共识,但是干细胞在小肠中的定位仍然是有争议的问题。利用长期DNA标签保留(LongTermDNAlabelRetention)测定,
Potten和同事提供了支持位于+4位置的帕内特(Paneth)细胞区室直接上方的的定位证据(综述于3、4中)。谱系追踪研究使得Bjerknes和Cheng认为不同的细胞类型,即所谓的隐窝基底柱状细胞,可以代表真实的干细胞。这些隐窝基底柱状细胞在隐窝的最底部与帕内特细胞互相混合(5)。
最近才提出肠干细胞的某些候选基因标志物即Musashi(6,7)和磷酸化-PTEN(8)。我们和其它人发现,Musashi表达区域含有每个隐窝30至50个细胞,这比存在的干细胞多得多(参见下文),而磷酸化-PTEN标志物可能表示人为产物(9)。取决于所用的试验方法,成体隐窝中的干细胞的数目估计为1个至6个(10)。这些年来,干性是否是通过不对称分裂自我延续的一组属性,或者隐窝底部是否充当为位于其中的祖细胞提供这些属性的小生境仍然是争论的问题。通过***化标签的分析进行的一个隐窝中的细胞谱系研究(11)表明,干细胞随机地以不对称的方式分裂(即,一个子干细胞加一个分化祖细胞)或者以对称的方式分裂(即,两个子干细胞或两个分化祖细胞)。值得注意的是,尽管从上述的研究推断出存在不对称和对称的细胞分裂,但是迄今为止在肠上皮的有丝分裂中尚未观察到决定因素的不对称分布的正式证据。当定向祖细胞达到结肠直肠隐窝上三分之一(或小肠中的绒毛)时,它们分化成吸收细胞(结肠细胞/肠细胞)或分泌谱系细胞(杯状细胞、肠内分泌细胞、帕内特细胞(Panethcells))
。从这一位置向上,分化的细胞继续朝向沿着隐窝-绒毛轴延伸的连贯带(coherentband)中的绒毛迁移,或者在结肠直肠上皮表面组成六角形状的聚簇。作为这个规则的例外,帕内特细胞朝着小肠中的隐窝底部迁移(综述于12中)。癌干细胞(综述于13、14中)癌干细胞假说假定,少量储存的自持细胞(self-sustainingcells)能够专门地自我更新并维持肿瘤。这些癌干细胞能够扩增癌干细胞池,但是也产生组成肿瘤主体的异质细胞类型。癌干细胞可以对已开发的用于根除组成肿瘤主体的快速分裂细胞的治疗相对耐受。癌干细胞还可以是最可能转移的细胞。因此,癌干细胞假说要求我们重新考虑我们诊断和治疗肿瘤的方式。治疗将必须靶向刺激肿瘤生长和转移的“少数”干细胞群体,而不是肿瘤的主体。癌干细胞假说处在快速发展的领域的中心,并且可能改变基础和临床研究者看待癌症的方式。在20世纪90年代,JohnDick和其他人对急性髓细胞性白血病(AML)的研究支持该病中癌干细胞的存在(15、16)。造血谱系图和不同细胞类型与谱系的细胞表面标志物的可用性极大地促进了确定造血恶性肿瘤中细胞起源的努力。推定的AML干细胞被证明能够在受照射的N0D/SCID小鼠中再生人AML。AML干细胞表现出类似于正常人造血祖细胞的⑶34+CD38—表型,这表明AML干细胞与正常干细胞之间的密切的相似性。最近,还在许多实体瘤中鉴定了癌干细胞。
Clarke和同事将来自人乳腺肿瘤的分级的细胞移植到N0D/SCID小鼠中。少至几百个的CD44+CD247低细胞能够在小鼠中建立肿瘤,而来自不同级分的上万个细胞不能诱导肿瘤(17)。这个实例后面有多个关于实体瘤的其它研究。例如,利用也在正常神经干细胞中发现的CD133标志物,从人成神经管细胞瘤和成胶质细胞瘤分离了能够在N0D/SCID小鼠中连续地产生可移植的脑瘤的脑瘤干细胞(综述于18中)。Hoechst染料排出的侧群(sidepopulation)(SP)细胞的分选和CD44的分选允许在前列腺癌中分离癌干细胞(综述于19中)。在文献中对于癌干细胞的定义有些混乱。在此处,我们采纳在最近的AACR研究会上达成的共识(14),其规定癌干细胞“是肿瘤内的细胞,具有自我更新和产生组成肿瘤的癌细胞的异质谱系的能力。因此癌干细胞只能够依据它们重演不断生长的肿瘤的产生的能力试验性地定义”。文献中的可选择的术语包括肿瘤起始细胞和致瘤细胞。癌干细胞活性的测定需要处理自我更新和肿瘤增殖的潜力。目前,金标准测定是免疫缺陷小鼠中的连续异种移植。作为癌干细胞的非限制性实例,更详细地讨论了结肠癌干细胞。结肠癌干细胞癌干细胞假说能够被外推至人结肠癌吗?两个最近的研究暗示确实是这样的。JohnDick和同事研究了⑶133作为结肠直肠癌细胞的标志物的用途(20)。⑶133或Prominin,是与多种组织和癌症中的干细胞群体和祖细胞群体有关的标志物。他们发现在
5%至20%的人结肠癌细胞上表达了⑶133。随后的连续异种移植测定证明,⑶133+细胞而不是CD133-细胞能够在免疫缺陷的小鼠中引发肿瘤形成。经计算,分离的CD133+%。沿着类似的路线,DeMaria和同事发现,⑶133+%的人结肠癌细胞,并且还证明这些细胞能够被连续地移植到免疫缺陷的小鼠中(21)。而且,利用含有EGF和FGF2的无血清培养基,能够将CD133+细胞在培养中维持长时间段。这些研究暗示,结肠癌可能代表了实体瘤的另一实例,其中少量的癌干细胞负责维持肿瘤。CD133标志物表达的分选明显地富集了癌干细胞,但是所得的细胞混合物非常不纯。因此,分选的细胞制备物(preparation)中癌干细胞的确切属性仍然是不清楚的,例如它们的细胞循环状态,或者它们对化学疗法或放射疗法的抗性。US2004/0058392和EP1400807描述了在结肠癌细胞系Lsl74T中确定的一系列TCF靶基因(22)。在这些申请中,推测在结肠癌细胞和肠隐窝中表达的这些分子将代表干细胞标志物。几种所述标志物编码细胞表面蛋白。US2004/0058392和EP1400807的发明人设想,这些蛋白能够用作选择肠道中高丰度的干细胞群体的标志物。然而,结果是这些蛋白的绝大部分不适合作为干细胞选择标志物,因为它们不是由干细胞(特异性地)表达的。例如,全部的分裂隐窝细胞表达CD44蛋白(23),cMyb(24)
和GPX2(25)也是如此。非分裂的肠内分泌细胞表达c-Kit蛋白(26)。全部的分裂细胞表达EphB2,而非分裂的帕内特细胞表达EphB3(27)。绒毛中的基质细胞表达BMP4(28)。Claudinl的表达几乎无处不在(29)。本发明提供了鉴定成体干细胞和/或组织干细胞以及癌干细胞的标志物。鉴定的成体干细胞和/或组织干细胞在受损或患病组织的修复中是有用的。本发明还提供了允许分离成体干细胞和/或组织干细胞和/或癌干细胞的方法。本发明还提供了用于培养或维持或繁殖(分离的)成体干细胞和/或组织干细胞和/或癌干细胞的体外方法。本发明还提供了允许鉴定和根除癌干细胞标志物的方法。本发明的一个目的是提供用于鉴定成体干细胞和癌干细胞的方法的新标志物。本发明的另一目的是提供适合维持/培养/繁殖/扩增成体干细胞的方法。本发明的另一目的是根除癌干细胞。成体干细胞通常是从组织分离的,因此又被称为组织干细胞。表面受体Lgr5和Lgr6在多种组织标记成体干细胞,并且在多种类型的癌症中标记癌干细胞。本发明人披露了表面分子Lgr5(又称为Grp49)和Lgr6的表达模式在多种组织中独立地标记成体于细胞,并且在多种类型的癌症中独立地标记癌干细胞。诸如LH、FSH和TSH的受体的糖蛋白激素受体属于大G蛋白偶联受体(GPCR)超家族,但是在携带对配体结合重要的大富亮氨酸胞外结构域中是独特的。人基因组中这些含有富亮氨酸重复的
G蛋白偶联受体被称为LGR。系统发生分析表明存在三种LGR亚型已知的糖蛋白激素受体;LGR4至LGR6;以及LGR7所代表的第三亚型(30)。LGR5和LGR6是本发明的主题。科学文献中没有描述这两类受体的配体;因此,这类受体通常被称为孤儿受体(orphan)。人、小鼠和大鼠受体的序列示于图10中。人LGR4包含951个氨基酸,其中447个氨基酸与LGR5中的对应氨基酸相同,并且其中485个氨基酸与LGR6中的对应氨基酸相同。人LGR5包含907个氨基酸,其中387个氨基酸与LGR6中的对应氨基酸相同。LGR6由967个氨基酸组成。这些受体的预测结构示于图11中。三个受体中,LGR4/GPR48是研究得最多的基因。根据科学文献,LGR4/GPR48在多种组织中广泛地表达(31、32),并不是特异性地与干细胞有关。在遗传小鼠模型中,LGR4/GPR48被描述为对子宫内生长(32)、雄性生育(33)和肾脏发育(34)是重要的。已经敲除了LGR5/GPR49。由于舌头和下颚缺陷,突变体胎儿在出生后死亡(35)。LGR5/GPR49在肝癌和结肠癌中是过量表达的(22、36、37)。除了初始克隆和序列分析以外,还没有对LGR6进行研究(30)。在第一实施方案中,本发明提供了用于获得(或分离)成体干细胞的方法,该方法包括下述步骤-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触-鉴定与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离。本发明的方法允许获得
(或分离)细胞集合(collection),该细胞集合包含、优选地仅包含至少50%的干细胞、更优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、最优选至少90%的干细胞,例如90%至99%的干细胞或者95%至99%的干细胞,所述方法包括下述步骤-任选地从正常组织或器官样本制备细胞悬液-使所述细胞悬液与Lgr6和/或Lgr5结合化合物接触-鉴定或获得与所述结合化合物结合的细胞-任选地将干细胞与所述结合化合物分离。分离的干细胞集合包含、并且优选地仅包含多于50%的干细胞,更优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、最优选至少90%的干细胞,诸如90%至99%的干细胞,或者95%至99%的纯多能干细胞,其能够保持未分化的表型。所述细胞在整生命周期中保持自维持的能力;并且能够在损伤后再生相关的组织。它们的后代,或非干细胞子代细胞,能够朝向相关组织中存在的全部谱系分化。能够从细胞悬液分离所述细胞集合,该细胞悬液包含干细胞和非干细胞子代细胞,例如定向的或分化的子代祖细胞(daughterprogenitorcell)。成体干细胞优选地是从胚后组织获得的干细胞。优选出生后的组织。在诸如人的灵长类中,优选地从至少一岁的个体获得成体干细胞,优选发育期后的个体。在本发明的优选实施方案中,所述干细胞是成体干细胞和/或癌干细胞。包含多于50%的多能干细胞的干细胞集合的主要优势是,与包含少于
50%的纯多能干细胞的干细胞集合相比,所述群体包含较少的能够不利地影响干细胞的自维持能力和/或干细胞的分化能力的细胞。这些具有不利影响的细胞包括非干细胞子代细胞或与干细胞共分离的其它非干细胞。
纯或几乎纯的成体干细胞的群体另外的优势是有限的细胞数目能够用作治疗其中相应的组织已经被侵袭的疾病的治疗剂,该治疗剂的组合物是公知的。优选地,所述干细胞是组织干细胞,诸如例如肠干细胞、皮肤干细胞或视网膜干细胞。本发明优选地提供了用于分离组织干细胞的方法,所述方法包括上文所述的步骤。所述干细胞不包括人胚胎干细胞。当分离成体干细胞和/或组织干细胞时,优选地从来自待分离的组织干细胞和/或成体干细胞的特定组织的细胞集合开始。通常,组织干细胞和/或成体干细胞定向形成所述组织的细胞,然而,能够例外地操作组织干细胞和/或成体干细胞来产生其它组织的细胞。干细胞是在多细胞有机体中发现的原始细胞。它们保持了通过有丝细胞分裂自我更新的能力,并且能够分化成多种范围的特化的细胞类型。哺乳动物干细胞的三种广泛类别是胚细胞(源自胚泡)、成体干细胞(在成体组织中发现的)和脐带血干细胞(在脐带中发现的)。干细胞的定义要求,干细胞至少能够自我更新(经历多个细胞分裂周期而维持未分化状态的能力)并且具有无限的潜能