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专利名称::用于细菌基因组扩增反应的引物的制作方法
技术领域:
:本发明涉及用于在细菌的16SrRNA编码区中的基因组扩增反应的引物。本发明还涉及此类引物的组合的引物组、具有这种引物组的试剂盒以及借助引物组检测细菌的方法。相关技术的说明过去和现在主要采用常规培养方法在检测对象(例如血液和痰)中鉴定引起传染性疾病的致病性细菌。随后通过观看菌落特征和每种培养基的生长条件来鉴定致病性细菌。已经提出了一些建议来改进现存的鉴定致病性细菌的技术,并且提供了新技术以使对病人的治疗和药疗更加快速和更加合适。新提出的有代表性的技术包括那些分析细菌DNA序列并从DNA序列中鉴定细菌物种的技术。例如,Ezaki等人在日本专利申请特开平2001-299396中提出了一种使用DNA芯片(其中染色体DNA被锚定为DNA探针)的细菌鉴定方法。采用这种建议的方法,有可能通过让源自多种已知细菌的具有各自的互相不同的GC含量的染色体DNA和源自检测对象中的未知细菌的染色体DNA发生反应并检测产生的杂交复合物,来检测检测对象中的未知细菌。0hno等人在日本专利申请特开平H06-133798中提出了一种真菌检测探针,其使用限制性酶切片段作为探针用于DNA芯片中,用于在传染性疾病中检测传染性细菌。0hno等人在日本专利申请特开平
H10-394896和日本专利申请特开平H10-304897中进一步提出了一种绿脓假单胞菌CPseM咖加asaeri/^f'/7Ma)检测探针和分别使用大肠埃希氏杆菌(&c力er/cA/aco//)、肺炎克雷白氏杆菌U7e6"'e7/a/7/3e咖o/7/se)和阴沟肠杆菌(i^fero6a"erc/oacae)限制性酶切片段的检测探针。日本专利申请特开平2004-313181公开了一种使用具有相对较短链长的寡核苷酸作为探针制备的DM芯片,以用来增加检测的准确性。公开的芯片能鉴定如下所示的10种不同物种,它们极为经常被临床检测为传染性细菌。金黄色葡萄球菌a"re^)、表皮葡萄球菌Ue;/^3r/n/(f/力、大肠埃希氏杆菌(Act/2')、肺炎克雷白氏杆菌(J.;wei/迈c/2/ae)、绿脓假单胞菌("《/'/oiT3)、粘质沙雷氏菌鹏rce"e/力、肺炎链球菌;7/2e"/z70/7/ae)、流感嗜血杆菌(V.///7i/e/zse)、阴沟肠杆菌c/oacae)、粪肠球菌/"aeca/i'ir)。采用上述引用的专利文件中公开的方法,选择那些细菌物种的细菌特异性寡核苷酸探针,来观察哪种细菌的探针和检测对象中的DNA杂交并确定细菌物种。更特别地,检测对象中的DNA被提取出来并随后在预备过程中通过PCR进行扩增,来扩增并标记目标核酸区域。随后,所获得的PCR产物和DM芯片中的任意探针杂交,并根据DNA芯片的亮度数据鉴定细菌物种。日本专利申请特开平2004-313181的鉴定细菌类型的方法包含了PCR扩增的预备过程。虽然
PCR扩增是一种高效的核酸扩增技术,但是它的有效性依赖于在检测对象中含有的模板的数量而变化。例如,在琼脂培养基上培养的细菌的数量非常多,因此当PCR提供一定水平的扩增效果时,有可能实现足够程度的检测灵敏度。当检测对象是人血液时,如果样本被培养一整天,并生长到扩增的足够水平,那么就可以获得足够数量的细菌基因组,或足够数量的模板。但是,当人血液中含有的细菌未经培养(扩增)并且直接鉴定细菌物种时,需要非常高水平的检测灵敏度,因为血液中的细菌浓度非常低,并且在显示高细菌浓度的败血症的情况下lmL血液最多含有几十到几百个活的细菌。当血液中的细菌未浓缩时,对于血液来说,。这样,源自细菌的基因组的数量最多等于大约100个细菌的基因组的数量。当然,在严重性较低的传染性疾病中血液中的细菌浓度更低。在PCR扩增中,理论上在每个循环中模板的数量增加一倍,因此对于PCR扩增有可能从一个拷贝的模板起始。但是,PCR扩增的效率通常不会高于2倍,并且当模板数量少时模板显然实际上没有被扩增的情况也时常发生。有各种增加或降低PCR效率的因素,有代表性的包括酶的种类、热循环程序、引物序列和緩冲液条件,其中引物序列对于增加或降低PCR效率是重要的。因此,选择正确的引物是重要的。发明概述为了能有效率地扩增许多不同物种(例如,62个物种
)的细菌,必须制备两种或两种以上不同种类的引物的混合物。但是,设计每个引物并且选择引物的合适组合通常是困难的。因此,本发明的目的是提供引物或引物组,其能有效扩增选自大量细菌物种(特别的是62种)的目标细菌的16SrRM基因序列。作为深入研究的结果,本发明的发明人发现,具有选自下面列出的序列号l-6的碱基序列的引物作为扩增选自62种细菌的16SrRNA特定区域的引物是有效的。因此,根据本发明的用于PCR的引物是用于细菌16SrRM基因序列的PCR扩增的引物,其具有选自于下面列出的序列号1-6的碱基序列。(1)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列号1)(2)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列号2)(3)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列号3)(4)ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列号4)(5)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号5)(6)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号6)根据本发明的用于细菌16SrRNA基因序列的PCR扩增的细菌基因组扩增反应引物组,包括下面列出的引物(A)-(L)中的至少两种,其中至少一种选自于引物(A)-(F)。(A)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列号l)的引物,(B)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列号2)的引物,(C)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列号3)的引物,(D)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列号4)的引物,(E)具有
ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号5)的引物,(F)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号6)的引物,(G)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAG(序列号7)的引物,(H)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG(序列号8)的引物,(I)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG(序列号9)的引物,(J)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATAC(序列号10)的引物,(K)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC(序列号ll)的引物,和(L)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC(序列号12)的引物。根据本发明的试剂盒是包括如上限定的引物或引物组并且适合用于鉴定细菌的试剂盒。根据本发明的细菌鉴定方法是使用如上限定的引物或引物组的基因组扩增方法,通过DM探针来检测细菌基因组。因此,通过根据本发明的引物,有可能进行62种细菌物种的任意一种的16SrRM的特定区域的非常有效的PCR扩增。并且,借助于根组,还可^非常^"效的扩增所有62种细菌。一''根据下述例示性的实施方案,本发明的进一步特征将变得更为清楚。发明详述根据本发明的引物是用于扩增细菌基因组16SrRM的特定区域的引物。它是具有选自下面列出的序列号1-6的碱基序列的引物。(1)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列号1)(2)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列号2)(3)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列号3)(4)ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列号
4)(5)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号5)(6)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号6)根据本发明的引物能被应用于任何细菌或源自于活体的对象,只要它具有能允许PCR扩增的基因组,无论序列是否一致。根据本发明的引物的主要的合适的应用是扩增下面62种细菌物种。金黄色葡萄球菌a盯e"力、表皮葡萄球菌(i".ep/^r/z7/d/力、大肠埃希氏杆菌(Aco//)、肺炎克雷白氏杆菌OT.;/2e咖o/72'ae)、^7/70sa)、粘质沙雷氏菌迈srce"e"s)、肺炎链球菌(S,/7/e咖o/7/ae)、流感嗜血杆菌(〃.2'/2/7〃e"zfle)、阴沟肠杆菌c/oacae)、粪肠球菌(A./aeca"力、溶血葡萄球菌(〃c^Ay)、人葡萄球菌(义^o/ff/zn's)、腐生葡萄球菌UM/7r0/7力/"cM)、荧光假单胞菌(尸./7"oresce/z力、恶臭假单胞菌(〃^3)、洋葱伯克霍尔德菌(Acepac/a)、鲍曼不动杆菌(A6a咖a/2///)、蜡状芽孢杆菌(Acerews)、枯草杆菌(Aw6"7/s)、醋酸钩不动杆菌(丄ca7coace"'cu力、木糖氧化产碱菌U1//0服2禱)、猪霍乱沙门(氏)菌Uc力o/erae頻、)、龟分支杆菌(#.C力e/o/zae)、星状诺卡氏菌、产酸克雷伯氏菌(汇o^^oca)、产气肠杆菌U2eroge/ie力、蜂房哈夫尼菌(Aa/rei)、液化沙雷氏菌/勿t/e尸ac/e/^)、奇异变形菌('ra627")、普通变形菌(尸.^/^sW》、摩氏摩根(氏)菌(脱J770i^a"//)、雷氏普罗威登斯菌("ger/)、嗜水气单胞菌
(AA^/o/^7a)、无乳链球菌a^3/ac〃ae)、变异链球菌(i1.、化脓链球菌AFO^e"e》、血链球菌、鸟肠球菌(Aaw'咖)、屎肠球菌(A尸aec/咖)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(^则/"/7力///3)、弗劳地氏柠檬杆菌(C./Vei//^27)、温和气单胞菌(丄so6r/a)、创伤弧菌(K^///7//7cw》、***加德纳氏菌、脆弱类杆菌(及/Vag//")、多形拟杆菌(及Me"/o"o迈/cro/2)、痤掩丙酸杆菌("e》、难辨梭状芽孢杆菌()、产气荚膜梭状芽孢杆菌(^ew)、迟緩埃格特菌(A7e/2")、核粒梭杆菌(尸.""c/eaM迈)、"s)、普氏厌氧球菌";re^7〃/)、不解糖嗜胨菌(/〃ci^)、不解糖p卜啉单胞菌(〃CS)、牙龈卟啉单胞菌(尸.《//7《2>3//力、白喉棒状杆菌()、侵肺军团菌U./7/e咖op力"a)、堪萨斯氏分枝杆菌(#.h/^w//)、胞内分枝杆菌//"ace//i//are)、坏死梭杆菌(A/zecro/7力or"/77)和栖牙普雷沃氏菌(〃co/a)。根据本发明的引物被设计为能够特异性地识别16SrRNA区域并通过PCR扩增它们。换句话说,引物被设计为不仅显示扩增细菌DNA序列的目标区域所必需的特异性序列,同时还不显示和源自人类的、可能在从血液中收集细菌基因组时同时存在的DNA序列相似的任意序列。另一方面,不管细菌物种中的菌林差异和突变而能均匀扩增目标细菌的序列是合适的。目标检测对象需要处在
PCR试剂能直接反应的条件下,如在从细菌中提取的DNA的情况下,虽然达到该条件的过程不受任何限制。换句话说,培养在液体培养基或琼脂培养基中的任意细菌能被使用,只要它们的基因组能被提取或和PCR试剂反应。检测对象可选自于源于人类和家畜的能存在细菌的任意样本,包括体液,包括血液、血液组分、脊髓液、痰、胃液、***分泌物和口腔内粘液,和排泄物,包括尿和粪便。此外,检测对象还可以是所有能被细菌污染的介质,例如能发生食物中毒或污染的食物和饮料,环境中的水例如温泉水,或空气清洁器的滤器。此外,检测对象还可以是选自于进出口检疫筛查中的取自动物和植物的样本。此外,检测对象还可以选自于通过任意不同的生物化学技术所获得的对象,例如各种试剂、PCR产物和用限制性酶处理的核酸片段。根据本发明的引物能和通常使用的任何与PCR扩增相关的技术一起使用。有可能选择分别针对正侧(F链)和反侧(R链)的引物(任意选择的浓度),并将它们用于PCR扩增。还可能只使用一个链进行不对称PCR扩增。还可能使根据本发明的引物在其任意位置接受任意选择的标记。例如,可以标记荧光物质或放射性同位素。根据本发明的引物能被用在通过混合多种不同类型的F链和R链所获得的混合引物中。引物混合物可以根据扩增对象进行任意配制。可以优选使用包括下面列出的引物(A)-(L)中的至少两种引物的引物组,其中至少一个选自引物
(A)-(F)。(A)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列号l)的引物,(B)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列号2)的引物,(C)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列号3)的引物,(D)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列号4)的引物,(E)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号5)的引物,(F)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列号6)的引物,(G)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAG(序列号7)的引物,(H)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG(序列号8)的引物,(I)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG(序列号9)的引物,(J)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATAC(序列号10)的引物,(K)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC(序列号ll)的引物,和(L)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC(序列号12)的引物。优选包括(D)到(I)的至少6种引物的引物组,和包括(D)、(F)、(G)、(H)、(I)和(K)的至少6种引物的引物组。此外,优选的是通过等量混合(D)到(1)6种引物所制备的引物组和通过等量混合(D)、(F)、(G)、(H)、(1)和(K)这6种引物所制备的引物组。以平衡良好的方式,这种引物组能够扩增上面列出的62种细菌物种。如果在检测对象中含有的细菌物种是未知的,那么根据本发明的引物组能适合用于PCR扩增,以通过某种或其他方法来分析PCR产物。当在根据本发明的引物组中使用了两种或两种以上引物的混合物时,有可能任意并且独立地标记每种引物组分。可以无限制地使用能用于PCR的任何酶
(热稳定DM聚合酶)。、ABI(AppliedBiosystems)生产的AmpliTaqGold和InvitrogenCorporation生产的AccuPrime。在PCR扩增反应中,除了普通底物以外还有可能将标记的底物和PCR反应溶液相混合,并使PCR产物接纳源自底物的标记。根据本发明的引物和引物组能被用于多种应用中,没有任何特定的限制。例如,根据本发明的引物或引物组能被用作探针,锚定在DNA微阵列的固相载体上。如果是这种情况,那第根据本发明的并显示高扩增率的引物能合适地用于有效制备DNA微阵列。当检测观察对象(检测对象)以发现检测对象中含有的细菌物种时,根据本发明的引物能非常有有效率地进行扩增。虽然可以使用各种技术中的任一种来分析PCR试剂产物(扩增产物,但流行的分析技术包括电泳方法、测序方法、定量PCR方法和使用DNA微阵列的分析方法。在这些方法中,特别有利地采用使用DNA微阵列的技术,在所述DNA微阵列上锚定有用于检测作为检测对象的目标核酸的探针,因为扩增区域中的序列能更简单的方式被定量分析。更特别的,对于不知道能否在其中发现细菌的检测对象,借助于能扩增所有62种细菌物种的引物组对所述检测对象进行PCR扩增,来获得PCR产物。通过再次使用标记性引物进行PCR来标记获得的PCR产物。标记的PCR产物和DNA微阵列杂交,并观测微阵列来找到微阵列上的对于杂交实际上起作用的探针,并且对杂交程度进行定量。使用