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用于筛查31种血液病融合基因的试剂盒的制作方法
本实用新型公开了一种用于筛查31种血液病融合基因的试剂盒,包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫,所述衬垫将所述盒体分隔为上下两部分,所述衬垫上设有小孔,装有32条逆转录特异性引物的试剂管、装有dNTP的试剂管、装有逆转录酶的试剂管、装有RNA酶抑制剂的试剂管和装有逆转录缓冲液的试剂管、装有PCR?MIX试剂的试剂管被设置在所述小孔内;分别装有110条PCR扩增引物的试剂管被放置在所述衬垫下方的盒体内。该试剂盒结构简单、设计合理,在使用该试剂盒筛查31种血液病融合基因时,可以快速、简便地得到检测结果,便于在临床检测中推广应用。
【专利说明】用于筛查31种血液病融合基因的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于分子生物学【技术领域】,涉及一种用于筛查31种血液病融合基因的试剂盒。
【背景技术】
[0002]随着分子生物学技术的发展,科学工作者们发现越来越多的血液病的发生、发展与基因异常有关,目前已发现与白血病有关的基因多达数百种之多,通过检测这些基因可以帮助血液病的的类型、判断预后、指导治疗、检测微小残留白血病(MRD)。
[0003]目前常检测的与血液病有关的基因如下:
[0004](DCBFB/MYHll:Inv(16)(pl3q22)是急性髓系白血病(AML)特征性染色体异常,通常见于AML-M4EO亚型,占总AML患者的10%,其中50%发生在AML-M4EO中。带有Inv(16)(pl3q22)的病人通常有较好的预后。该基因阳性的病人,可用于疗效监测和微小残留的检测。
[0005](2)AML1/ET0:t(8,21)(q22;q22)在1973年首次报道。AMLI/ETO融合基因出现在所有的t(8,21)阳性的AML中,同时也出现在具有复杂移位的t(8,21)阴性的AML病例中。t(8,21)出现在大约7%的AML病例中,在年轻的患者中更为常见。其主要出现在AML-M2这一亚型中,大约有20-40%病例具有t(8,21)。在非常少见的AML-Ml,AML-M4和t_AML中也有报道。t(8,21)异位是一个较好的标志,它的存在使这类病例对一些药物有较好的反应。因此基于细胞遗传学和分子遗传学的检测结果,可以为病人选择风险低的较好的治疗方案。该基因阳性的病人,可用于疗效监测和微小残留的检测。
[0006](3)PML/RARa:t(15,17)易位是APL的一个典型标志,其易位造成了15号染色体上的PML基因和17号染色体上的RARa基因的融合,产生了一个融合基因PML/RARa。由于PML基因上融合位点的不同,PML/RARa有三种融合型,即:bcrl(55%),bcr2(5%),bcr3(40%)。检测PML/RARa融合基因的存在与否,对
APL的诊断,判断ATRA的疗效和预后复发都非常重要。PML/RARa阳性强烈预示着复发的可能,而其持续性阴性则预示病人有更长的生存期。该基因阳性的病人,可用于疗效监测和微小残留的检测。
[0007](4)E2A/PBX1:t(1:19)导致了19号染色体上的E2A基因和I号染色体上的PBXl基因的融合,产生了融合基因E2A/RBX1,在5-6%的儿童ALL和3%的***ALL检测到,几乎全部出现在前B细胞ALL病例中。携带有该易位的病人,其临床症状都比较凶险。该基因阳性的病人,可用于疗效监测和微小残留的检测。
[0008](5)MLL/AF4:在50-70%的婴幼儿ALL和将近5%的小儿和***ALL病例中有MLL/AF4融合基因。t(4,11)(q21;q23)与前B-ALL(CD79A+,CD19+,CD10-,CD24-)相关,同时与粒系分化抗原⑶16和⑶65以及NG2抗原共表达。MLL/AF4融合基因在所有t(4;11)移位的病例中存在,也存在于相当一部分细胞遗传学没有检测到t(4;11)移位的病例中。在婴幼儿ALL中MLL/AF4融合基因被认为是预后不良的标志。在***ALL中也是一个不良的标志,但对于***ALL,该融合基因的存在似乎能增强高剂量的Ara-C的疗效。该基因阳性的病人,可用于疗效监测和微小残留的检测。
[0009](6)BCR/ABL:在超过95%的CML病人的白血病细胞中,30%(20-50%)的***ALL和2-10%的儿童ALL中,以及小于2%
的AML(淋巴瘤和骨髓瘤)的病例中有BCR/ABL融合基因。在CML中BCR/ABL融合基因都是p210型的,在CML病例中有55%的b3_a2型,40%的b2_a2型。在5%的病例中b3_a2和b2_a2型由于剪接的不同同时存在。另外,在非常少的ph+的CML病人中存在一种大的BCR/ABL融合基因el9_a2,即u_bcr,p230型BCR/ABL融合基因。在30-50%的***ph+的ALL,20-30%儿童ph+的ALL病例中BCR/ABL融合基因是P210型的。还有60%的ph+的ALL患者的BCR/ABL融合基因是pl90型的。在ALL中,Ph阳性和随之出现的BCR/ABL融合基因是一个非常不好的标志,它影响着病人血相的完全缓解率和可能的生成率。该基因阳性的病人,可用格列卫进行治疗,并可进行疗效监测和微小残留的检测。
[0010](7)TEL/AML1:t(12;21)(pl3;q22)易位最早在1995年被报道。随后的报道发现这种普通遗传学无法检测的易位,是儿童ALL中最为常见的易位。几乎25%的小儿ALL有该易位。其主要的阳性病人出现在1-12岁之间,其中最多的在2-5岁的这个年龄段。所有的病例其免疫分型都是前B细胞ALL。另外,这类病人的另一个特征是其白细胞比较低。t(12;21)阳性的病人都有较好的预后,其复发的时间也会较晚。该基因阳性的病人,可用于疗效监测和微小残留的检测。
[0011](8)SIL/TAL1:位于染色体1ρ32上的TALl基因可以通过多种遗传变异导致在T细胞中异常表达。其中最常见的重组方式是
TALl基因上游约90kb的DNA缺失,导致SIL与TALl融合,这种染色体内微缺失全部出现在T-ALL病例中。SIL/TAL1融合基因与T-ALL的免疫表型密切相关。SIL/TAL1融合基因可以在26%的儿童T-ALL病例和16%的***(主要是年轻***)T-ALL病例检测到。SIL/TAL1融合基因与T-ALL预后的关系还不是很清楚。该融合基因可以用于T-ALL的辅助诊断,该融合基因还可以用于疗效监测和微小残留的检测。
[0012](9)EVI1:定位于染色体3q26。在小鼠逆转录病毒诱发的急性髓系白血病模型中,EVIl是病毒常见的插入位点。EVIl编码一个能结合DNA的锌指蛋白,其过度表达在髓系恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用。与其表达相关的还有MDS和CML。现阶段的研究表明EVIl高表达的患者的预后不良,但其机制尚未清晰。
[0013](IO)HOXll:据细胞基因学研究,4-7%的T-ALL中涉及染色体10q24的易位。HOXll正是定位在10q24上,并被t(10;14)(q24;qll)易位以及t(7;10)(q35;q24)易位激活。B-ALL中无HOXll的发现。在现阶段的文献报道中,HOXlI高表达的儿童T-ALL的预后较阴性者有优势。***中也有相似的论断。低表达的HOXll与阴性者无统计学差异。
[0014](11)MLL/AF10:MLL/AF10与AML相关,染色体上表现为t(10;ll)(pl2;q23)的易位,主要见于AML-M5型患者,儿童多见
,80%的患者小于3岁。MLL/AF10阳性的患者的预后差。
[0015](12)MLL-AF9:t(9;ll)(p22;q23)易位主要发生在AML中,是AML中t(llq23)最常见的易位形式。MLL-AF9的病人的预后较差。
[0016](13)MLL/ENL:t(ll;19)(q23;)易位可见于ALL,AML-M4,M5,Ml,M2。以小于I岁的婴儿多见,。易位导致MLL-ENL融合基因形成。预后尚无确切说明,与年龄,免疫表型相关。
[0017](14)MLL/ELL:t(ll;19)(q23;)%,为AML特征性异常,年龄以***为主。白细胞20X109/L,FAB分型M4或M5,免疫表型为⑶13⑶33,⑶14⑶15,⑶11,HLA-DR表达阳性。易位导致MLL-ELL融合基因形成。预后不良,2年无病生存率50%。
[0018](15)MLL/AFX:t(X;11)(ql3;q23)易位仅有体外分子的一些研究研究表明MLL-AFX可以增强造血干细胞的自我更新并阻止它们成熟。无预后相关资料。
[0019](16)MLL/AFlq:t(l;ll)(q21;q23)易位,多发于AML。关于MLL/AFlq的预后说法存在争论:在一项研究中,高表达的AFlq是一个独立的不良预后因子;另一项研究表明MLL-AFlq阳性的患者预后良好,是否因为MLL-AFlq的形成改变了AFlq的表达还不得而知。
[0020](17)MLL/AFlp:t(l;ll)(p32;q23)易位,ALL,AML,MDS中均有发现。中位生存期为15个月。预后与性别及分型相关,女性的中位生存期可达28个月,而男性为11个月。缺乏关于预后的相关文献。
[0021](18)PLZF/RARa:t(ll;17)(q23;q21)易位,特定的在急性早幼粒白血病或急性非淋巴细胞白血病M3型中发现。功能尚不明确。预后明显差与有t(15;17)易位的ANLLM3型,其对ATRA的化疗无反应。
[0022](19)MLL/AF6:t(6;ll)(q27;q23)是llq23中常见的易位,长发与AML,特别是M4,M5中,在T-ALL中也有发现。预后非常差,几乎无缓解,生存期短。
[0023](20)MLL/MLL:llq23的部分串联重复(MLL-PTD),已经在10%的正常核型的AML中检测出MLL-PTD,可以作为稳定的MRD的监测标记。预后差,临床缓解率低。
[0024](21)TLS/ERG:t(16;21)(pll;q22)易位多见于年轻患者,FAB各亚型均见。预后不良,可能不能达到完全缓解,一年内的复发率高,中位生存期为22个月。
[0025](22)TEL/PDGFR:t(5;12)(q33;pl3)易位形成的融合基因,与Ras/ERK和STAT5信号传导通路相关,诱导干细胞的分化。预后尚不明确,中位生存期〈20个月(n=ll)。
[0026](23)TEL/ABL:t(9;12)(q34;pl3)易位罕见,至2010年只有19例被报道于CML,AML,ALL中。数量少,从报道的病例上看,预后不良。
[0027](24)SET/CAN:t(9;9)(q34;q34)易位,罕见,作用不明。有文献报道称SET-CAN可以抑制增生,促分化。
[0028](25)DEK/CAN:t(6;9)(p23;q34)易位,由位于9q34的CAN基因与6q23的DEK基因融合,CAN基因是产物核孔复合物的一部分,能够运送RNA及蛋白质穿过核膜。在AML中占2%,主要为M2型,其次为M4。最初描述是以骨髓中正常嗜碱粒细胞增多为特征20%患者有既往MDS病史。年轻患者(20?30岁)。预后差。
[0029](26)MLL/AF17:t(11;17)(q23;ql2-21)易位,发现于AML中。无预后相关文献。
[0030](27)E2A/HLF:t(17;19)(q22;pl3)易位产生E2A/HLF融合基因,发生在其少数的
ALL病例中。预后差,对密集化疗无反应,生存期短。
[0031](28)NPM/MLF1:t(3;5)(;q34)易位,在MPS,MDS,ANLL(M2,M4,M6)中有发
现。预后非常差,中位生存期少于I年。
[0032](29)NPM/RARa:t(5;17)(q35;q22)易位发生于急性非淋巴细胞白血病,见于M3,即急性早幼粒细胞白血病。病例少,有记载的只有2例儿童病例,2例的复发时间都短,预后可能不乐观。[0033](30)NPM1/ALK:t(2;5)(p23;q35)易位,2p23的易位发生在超过一半的间变性大细胞淋巴瘤
(ALCL)中,一种高级的非霍奇森淋巴瘤。虽然发生于高等级的侵袭性肿瘤中,但80%患者的生存期长于5年。
[0034](3DAML1/MDS1:t(3;21)(q26;q22)易位发生于CML(约占1%),ANLL和MDS中,通常与治疗相关。预后不良,生存率低。
[0035]目前临床常采用细胞遗传学检测分析染色体核型来识别、筛查染色体结构畸变形成的融合基因,但该方法检测周期长,很难识别微小的染色体异位,常不能满足临床需要。
实用新型内容
[0036]为了解决上述技术问题,本实用新型的目的在于提供一种用于筛查31种血液病融合基因的试剂盒,可应用多重PCR技术同时在一个检测体系中对不同的融合基因进行检测,可以快速、简便地得到检测结果。
[0037]为实现上述目的,本实用新型采取的技术方案是:一种用于筛查31种血液病融合基因的试剂盒,包括盒体(I)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3),所述衬垫(3)将所述盒体(I)分隔为上下两部分,所述衬垫(3)上设有小孔,装有32条逆转录特异性引物的试剂管(4)、装有dNTP的试剂管(5)、装有逆转录酶的试剂管(6)、装有RNA酶抑制剂的试剂管
(7)和装有逆转录缓冲液的试剂管(8)、装有PCRMIX试剂的试剂管(9)被设置在所述小孔内;分别装有110条PCR扩增引物的试剂管被放置在所述衬垫
(3)下方的盒体内。
[0038]其中,所述试剂盒还包括:装有去离子水的试剂管(10)。
[0039]其中,所述衬垫(3)上设有7个小孔,所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
[0040]其中,所述32条逆转录特异性引物序列如下:
[0041]FG15’-GCTGACATTGAT-3’
[0042]FG25’-ACTCAAGCTGTG-3’
[0043]FG35’-CCACGTGTGCCTCTC-3’
[0044]FG45’-GTATTGACAGTAT-3’
[0045]FG55’-GACACCTTGAAG-3’
[0046]FG65,-ATGGCTGGCTCAG-3’
[0047]FG75’-AGGTCATTTTGAG-3’
[0048]FG85,-TTCCTCCTCTGAG-3’
[0049]FG95’-CCGATCAATCTTT-3’
[0050]FG105,-CTGCCACACTT-3,
[0051]FGl15,-GCATAACAGTTGT-3’
[0052]FG125’-AAGTCTCCAACAG-3’
[0053]FG135’-TTTGCACTCTGAT-3’
[0054]FG145’-CGGTAATCGATTTC-3’
[0055]FG155,-CCCGTAACATAAC-3,
[0056]FG165,-TAAGGCTGCTCT-3,