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专利名称:用于生产乙醇酸的固定的微生物***水解酶的改进的制作方法
技术领域:
本发明涉及有机酸的合成和微生物学领域。更具体地,本发明提供了制备酶催化剂的方法,所述酶催化剂在乙醇***水解为乙醇酸过程中的初始***水解酶活性的保留得到改进,所述方法包括在固定和交联之前以戊二醛预处理酶催化剂。如上所述,与未经戊二醛预处理的固定的和交联的酶催化剂相比,戊二醛预处理的固定的和交联的酶催化剂具有改进的比活性,从而具有将乙醇***转化为乙醇酸的改进的总的催化剂活性、催化剂生产力和单位体积生产力。
背景技术:
乙醇酸(H0CH2C00H;CAS注册号为79-14-1)是羧酸的α-羟基酸家族的最简单的成员。乙醇酸的性质使其具有理想的广范围的消费和工业应用,包括用于水井复原、皮革工业、油气工业、洗衣和纺织工业、作为单体制备聚乙醇酸(PGA),以及作为个人护理产品的成分。乙醇酸还是多种工业上的清洁剂(奶制品和食品加工设备清洁剂,家居和机构清洁剂,工业清洁剂[用于运输设备、石工技术、印刷电路板、不锈钢锅炉和处理设备、冷却塔/热交换器]和金属加工[用于金属酸洗、铜的抛光、蚀刻、电镀、电解法抛光
])的主要成分。也有报道指出乙醇酸可作为气体屏障材料(即显示出高度的氧气屏障特性)用于包装食物和碳酸饮料(WO2005/106005Α1)。但是,乙醇酸的传统化学合成产生大量的杂质,在使用前必须除去这些杂质。工业界迫切需要商业化生产乙醇酸的新技术,特别是以低成本生产高纯度乙醇酸的新技术。微生物酶催化剂能够使用***水解酶()将***(例如乙醇***)直接水解为相应的羧酸(例如乙醇酸),其中不产生相应的酰***中间体(反应式1);或者可通过***水合酶()与酰***酶()的组合将***(例如乙醇***)水解为相应的羧酸(例如乙醇酸),其中***水合酶(NHase)首先将***转化为酰***,然后酰***被酰***酶转化成相应的羧酸(反应式2))
权利要求
一种方法,用于改进乙醇***转化为乙醇酸过程中具有***水解酶活性的酶催化剂的初始比活性的保留,所述方法包括(a)通过发酵产生具有***水解酶活性的酶催化剂;(b)以戊二醛预处理所述酶催化剂;(c)任选地在戊二醛预处理之后以亚硫酸氢盐将未反应的戊二醛灭活;(d)从(b)或(c)回收酶催化剂并将所述酶催化剂固定于角叉菜胶中;和(e)以戊二醛和聚乙烯亚***将(d)中产生的角叉菜胶固定的酶催化剂进行交联,从而产生戊二醛预处理的固定的和交联的酶催化剂,并且其中所述戊二醛预处理的固定的和交联的酶催化剂在相同反应条件下与未经戊二醛预处理的固定的和交联的酶催化剂相比,在乙醇***转化为乙醇酸过程中的初始比活性的保留得到改进。
,其中(a)的酶催化剂包含氨基酸序列标志基序SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。
,其中所述酶催化剂包含具有选自SEQIDN0:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57的氨基酸序列的多肽。
,其中所述酶催化剂是敏捷食酸菌72W。
,。
,其中步骤(b)中以戊二醛进行预处理包括向步骤(a)产生的发酵液中加入大约3g/L()至大约5g/L()的戊二醛。
,其中步骤(b)中以戊二醛进行预处理包括以50mg/L/h至500mg/L/h的速率向步骤(a)产生的发酵液中加入戊二醛。
。
,其中所述催化剂在至少4个连续批式循环反应之后,保留其初始比活性的至少大约70%。
***水解为乙醇酸的改进的方法,包括改进乙醇***转化为乙醇酸过程中具有***水解酶活性的固定的酶催化剂的初始比活性的保留,所述方法包括(a)通过发酵产生具有***水解酶活性的酶催化剂;(b)以戊二醛预处理所述酶催化剂;(c)任选地在戊二醛预处理之后以亚硫酸氢盐将未反应的戊二醛灭活;(d)从(b)或(c)回收酶催化剂并将所述酶催化剂固定于角叉菜胶中;(e)以戊二醛和聚乙烯亚***将(d)中产生的角叉菜胶-固定的酶催化剂进行交联,从而产生交联的固定的酶催化剂;和(f)在合适的反应条件下,在水溶液中将(e)的交联的固定的酶催化剂与乙醇***接触,从而产生乙醇酸。
,还包括步骤(g)回收步骤(f)中产生的乙醇酸。
,其中在固定的酶催化剂的每克干细胞重产生至少40g乙醇酸之后,所述交联的固定的酶催化剂保留其初始比活性的至少大约70%,并且与另一种产生乙醇酸的方法相比,所述方法具有改进的生产乙醇酸的生产力,所述另一种产生乙醇酸的方法使用包含未经过戊二醛预处理的具有***水解酶活性的酶催化剂的交联的
固定的酶催化剂。
全文摘要
本发明提供了制备具有将乙醇***水解为乙醇酸的***水解酶活性的酶催化剂的方法,所述酶催化剂在具有催化剂循环的连续批式反应中其回收的催化剂活性的保留得到改进,所述方法包括以戊二醛预处理酶催化剂。与未经戊二醛预处理的酶催化剂相比,戊二醛预处理的酶催化剂具有改进的比活性,从而具有改进的总的催化剂活性和生产力。