用于检测疟原虫的引物的制作方法.docx

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专利名称::用于检测疟原虫的引物的制作方法
技术领域:
:本发明涉及能够快速和准确地检测/鉴定疟疾流行区的疟原虫属疾疾寄生虫的引物组、其^r测和鉴定方法、其^r测试剂盒、抗疟疾措施支持系统,和疟疾感染-预防/治疗措施系统。
背景技术:
:在许多疟疾寄生虫流行的国家,快速和准确地诊断疟疾寄生虫是一项挑战。在疰原虫属的四个种中,恶性疾原虫(Plasmodiumfalciparum)可能是致命的,必须迅速鉴定且从其他对人类致病的疟原虫种中区分出来(Moody,A.,(2002):66-78)。另外,大多数疟疾流行区典型的感染涉及两种或多种上述的种;这些混合感染经常认识不到或被低估(Zimmerman,,(2004):440-447)。混合感染检测的失败会导致治疗不充分,以及可能会导致严重的疾病(Mayxay,,(2004):233-240)。因此,亟需发展一种在痴疾流行区可行的、简便、快速、高灵敏度和种特异性的疟疾诊断方法。目前痴疾的简便诊断方法是血涂片的显微镜检。如果寄生虫密度很高,这种显微镜检具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确定发展阶段和种。然而,在寄生虫密度通常较低的流行区,该方法比较繁瑣,需要训练良好的专家,并且可能导致治疗上的延误。在一些标准实验室诊断无法开展的地区,为提高疟疾诊断的速度和精确性,研究
者们开发了基于免疫反应的痴疾快速诊断试验(RDT)(Moody,(2002):66-78;Ndao,,(2004):2694-2700)。然而,产品间的灵敏度有波动(Murray,,(2003):876-883),并且只有对恶性疟原虫的种特异性的产品。在以下几种情形下需要极长的观察时间和较多的技巧来通过显微镜检校正诊断当寄生虫血症呈低度时、在混合感染期间、在药物治疗之后、和在感染慢性期过程中。因此,这种状况可导致假阴性结果或不可靠的种诊断(Coleman,,(2006):121)。后来,开发出了用于疟疾诊断的基于DNA扩增的分子生物学方法,如套式PCR和实时定量PCR。与显微镜检相比,这些方法被证明对于混合感染具有较高的灵敏度和较好的特异性(Kimura,,(1997):91-95;Perandin,,(2004):1214-1219;Rougemont,,(2004):5636-5643;Singh,,(1999):687-692;Singh,,(2004):1017-1024;S麵画,,
(1993》283-292;S醒顏,,(1993):315-320)。然而,较长的运转时间、高成本、和仅能在装备良好的实验室进行使得该PCR技术无法胜任医院实验室和流行区的现场诊所的常规i诊断(Hanscheid,,.,TrendsParasitol,18(2002):395-398)。关于疟疾4企测,专利文件1的实施例8和1(V^开了一种,人血液样品中提取核酸和进行套式PCR来检测痴原虫属的四个种的方法。实施例8公开了每个正向引物和反向引物序列,它们与本发明的引物序列不同(专利文件1)。专利文件2和4的专利公开文本公开了基于固相方法或套式PCR检测一种或多种疾疾感染的方法,其中使用多种类型引物中的一个或多个进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的临床检测。然而,这些引物与本发明的引物具有不同的引物序列。专利文件3的专利公开文本公开了一种检测恶性疾原虫和/或间日痴原虫的方法,其中恶性痴原虫和/或间日症原虫特异性引物结合10于标记物或固相支持物上。然而,这些特异性引物序列不同于本发明引物组的寡核苷酸序列。最近,开发出了一种新型、简便和高灵敏度的技术,称为环介导的等温扩增(LAMP)(Notomi,,(2000):e63;WO2000/28082)。LAMP是一种核酸扩增方法,它依赖于由BstDNA聚合酶运行的自动循环链置换
DNA合成。扩增产物为具有靶标的几个重复序列的茎环结构,并且具有多个环。该法的主要优点是不需要DNA模板的变性(Nagamine,,(2001):1742-1743),并且因此LAMP反应可以在等温条件下运行(范围从60。C至65°C)。LAMP仅需一种酶和四种类型的能够识别六个不同耙区域的引物。该方法产生大量的扩增产物,使得检测十分容易,如通过目视判断反应混合物的浊度或荧光进行检测(Mori,,(2001):150-154)。使用荧光物质如荧光素、异硫***酸荧光素(FITC)、X-罗丹明(ROX)或类似物来测量反应混合物的荧光极性值的LAMP,以及使用SYBRGreen2(—种绿色染料)作为嵌入剂的LAMP是已知的(-272475,和WO2002/103053)。几名研究人员已经报道了LAMP方法在快速鉴定疟原虫、锥虫(Trypanosoma)、巴贝虫(Babesia)、镰孢霉(Fusarium)、李斯特氏菌(Listeria)和军团菌(Legionella)中的应用,并且推荐了LAMP试验的有效性(Ikadai,,(2004):2465-2469;Kuboki,,(2003):5517-5524;Thekisoe,,(2002):223-236;-245257,-61061,-219878和
Poon,,(2006):303-306)。对于恶性疟原虫4企测,Poon等人估计运行LAMP试验的成本大约是标准PCR的十分之一(Poon,,(2006):303-306)。成本和时间的大幅缩减是由于无需前期DNA提取的简单样品制备(Iwasaki,,(2003):119-126)。对于样品制备,在99。C下简单加热感染的血液IO分钟就能够制备可用于LAMP的DNA模板(Poon,,(2006):303-306)。但是,至今为止,临床诊断中用于疟疾寄生虫检测的LAMP仅在急性恶性疰原虫患者中得到确证(Poon,,(2006):303-306)。尽管恶性痴原虫是重症疾病的最重要的病因,但是它的地理分布与间日症原虫、三日痴原虫和卵形疾原虫感染的地理分布有重叠,因此希望有一种能够快速检测和鉴定感染人类的所有四个种的方法。近些年来,在疟疾流行区,抗药才朱的发展已成为适当的疟疾治疗的主要问题。医务工作者或医院医生亟需快速和高灵敏度的区分方法,以获得关于发热患者是感染了一种特定疟疾寄生虫还是多种痴疾寄生虫的信息,从而适当地治疗该发热痴疾患者。WO2006/"4-261758[专利文件3]-227998[专利文件4]日本未审查的专利7^-250564[非专利文件1]Poon,,(2006)::30、30
发明内容本发明将要解决的问题为解决上述问题,亟需开发简便和快速的方法用于检测和鉴定疾原虫属的四种疟疾寄生虫(特别是,混合感染的存在),这些方法应当不同于已知的方法如显微镜检或PCR反应介导的方法。本发明的目的是提供快速和高灵敏度的检测和鉴定方法,用于使用LAMP临床才企测和确定恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疾原虫。而且,根据本发明的痴疾寄生虫4全测和鉴定方法,使用症疾流行区诊所获得的血样,提供用于4企测疾原虫属和四种痞疾寄生虫的引物组,其中该引物组已经通过显微镜检和LAMP的比较得到了评估;提供应用该引物组检测疰原虫属的四种症疾寄生虫的检测方法;提供鉴定方法;以及提供检测试剂盒。因此,本发明的目的是解决上述问题,以及提供简便和快速的测/'鉴定方法,用来确定人标本中疟原虫属寄生虫或症疾寄生虫的四个具体种中任一种的存在与否,其能够对症疾流行区的医疗处理有帮助,并且进一步提供抗症疾措施支持系统和痴疾感染-预防/治疗措施系统。解决问题的方法为解决这些问题,本发明的发明人想到使用环介导的等温扩增(LAMP)方法,其为一种等温基因扩增反应(WO00/28082)。但是,一般来讲,疰疾寄生虫基因的核酸序列与其他生物体大大不同,富含AT成分。因此,现有的引物设计软件无法获得最优的引物组,在设计每种类型的引物时就需要困难的反复的试错过程。最终,在合成引物组的许多组合中,发现同时具有高灵敏度和高特异性的特别有用的引物组。因此,人们发现使用能够同时检测疟原虫属寄生虫的四个感染人类的种的属特异性引物组,
以及各自特异性针对四种寄生虫(恶性痴原虫、间日痴原虫、三日痴原虫和卵形疟原虫)的引物组,允许容易且快速地检测/鉴定此类感染的存在与否。也发现这些结果可有效地用于抗痴疾措施支持系统,并且可以有效地使用疾疾感染-预防/治疗措施系统。即,本发明可提供下述第1至27项描述的内容。^r测或鉴定标本中症原虫属和/或恶性症原虫、间曰疾原虫、三日痞原虫和卵形*原虫中的一种或多种疾原虫的感染的方法;该方法包括以下步骤(a)至(c):a)从标本中提取DNA;b)通过使步骤(a)中提取的DNA在含有链置换DNA聚合酶和序13列特异性引物组的反应混合物中进行反应,来扩增疟原虫属18SrRNA基因序列的特定区域;和c)检测或鉴定在步骤(b)中扩增的疟原虫属和/或恶性疟原虫、间曰疰原虫、三日症原虫和卵形痴原虫中的一种或多种痴原虫的扩增产物的存在与否;所述序列特异性引物组是含有SEQIDNO:1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组,用于扩增疟原虫属18SrRNA基因序列的特定区域;和/或以下引物组中的一个或多个包含含有SEQIDNO:7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组,用于扩增恶性疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域;包含含有SEQIDNO:13至18、SEQIDNO:31至36或SEQIDNO:37
至42表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组,用于扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域;包含含有SEQIDNO:19至42表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组,用于扩增三日症原虫18SrRNA基因序列的特定区域;和包含含有SEQIDNO:25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组的引物组,用于扩增卵形疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。,其中从标本中提取DNA是通过煮沸含有该DNA的标本并进行离心来完成的。,其中煮沸时间是从数分钟至十数分钟。,其中,在扩增痴原虫属18SrRNA基因序列的特定区域的步骤(b)中,使用恒温水浴或特别为LAMP设计的扩增仪,在大约60。C下进行所述DNA扩增反应大约1小时。,其中,在步骤(c)中,利用目视观察或实时浊度计检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疾原虫、间日疾原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫中的一种或多种疾原虫的扩增产物的存在与否。,其在14症疾流4亍区进4亍。,其中同时或分别检测或鉴定疾原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、三日痴原虫和卵形痴原虫中的一种或多种疟原虫的感染。
1至6项中任一项所述的检测或鉴定方法,其中使用一个引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定疟原虫属的感染,该引物组包含含有SEQIDNO:1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组,用于扩增疾原虫属18SrRNA基因序列的特定区域。,其中使用用于检测间日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定间日疟原虫的感染,该引物组包含含有SEQIDNO:13至18、SEQIDNO:31至36或SEQIDNO:37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增间日痴原虫18SrRNA基因序列的特定区域。,其中使用用于检测三日疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定三日痴原虫的感染,该引物组包含含有SEQIDNO:19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增三日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。,其中使用用于检测卵形疟原虫的引物组作为序列特异性引物组来检测或鉴定卵形疟原虫的感染,该引物组包含含有SEQIDNO:25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组并且能够扩增卵形疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。,其包含含有SEQIDNO:1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组,该引物组能够扩增疟原虫属18SrRNA基因序列的特定区域。,其包含含有
SEQIDNO:13至18、SEQIDNO:31至36或SEQIDNO:37至42表示的核酸序列的寡核苷酸组,该引物组能够扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。,其包含含有SEQIDNO:19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组,该引物组能够扩增三日症原虫18SrRNA基因序列的特定区域。,其包含含有SEQIDNO:25至30表示的核酸序列的寡核苷酸组,该引物组能够扩增卵形症原虫18SrRNA基因序列的特定区域。、间日疟原虫、三曰痴原虫和卵形疟原虫中的任一种的引物组,其包含含有选自第12至15项中所述的核酸序列和SEQIDNO:7至12表示的核酸序列的寡核苷酸引物组,该引物组能够扩增痴原虫属以及疟原虫属的各个种的18SrRNA基因序列的特定区域,包括恶性疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。、间日疟原虫、三日疸原虫和卵形痴原虫中的任一种的检测试剂盒,其包含选自第12至16项所述的引物组的至少一个引物组、链置换DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。,其中该试剂盒同时或分别检测痴原虫属和/或恶性疾原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疰原虫。,包括用于输入和存储疟疾感染患者信息的装置,该信息包括疟疾流行区导致痴疾的痴原虫属寄生虫阳性的数字,以及该地区的携带率;痴疾感染