用于检测人类egfr基因19号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法.docx

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专利名称:用于检测人类egfr基因19号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法
技术领域:
本发明属于生物技术领域和医学领域,具体地,本发明涉及一种用于检测人类EGFR基因19号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法。
背景技术:
肺癌是较为常见的肺原发性恶性肿瘤,发病率和病死率较高,男性肺癌占各种癌病死因第一位,女性则仅次于乳腺癌占第二位。按传统的组织病理学分类,肺癌可分小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma,NSCLC)即“非小细胞癌”,包括鳞癌、腺癌、大细胞癌,与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚,非小细胞肺癌约占肺癌总敉的80-85%。上皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor;EGFR)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种,该家族包括EGFR(ErbB-I),HER2/c-neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR也被称作HERUErbBl,突变或过表达一般会弓I发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白,属于酪氨酸激酶型受体。研究表明,EGFR
突变基因与酪氨酸激酶抑制类药物使用有疗效关联,这些药物包括Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)。EGFR基因突变影响着EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的临床疗效,目前发现EGFR基因突变90%以上的突变位于外显子19-21。外显子19碱基缺失,主要是第746-752位密码子的碱基缺失突变,导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失,改变了受体ATP结合囊(ATP-bindingpoke,ABP)角度,显著增强了肿瘤细胞的敏感性。目前EGFR突变基因的检测方法有DNA测序法、特异性位点的聚合酶链式反应、荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱法、毛细管电泳分析。相对于DNA测序,其它分子生物学方法尽管灵敏度和/或特异度有所提高,但是大多数方法仍对组织的取材要求较高,需要较多的肿瘤组织和有较高的肿瘤细胞含量。此外,有的方法,如荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱和毛细管电泳等,需要特殊的仪器设备,因而仍然不能在临床上进行大范围推广。而聚合酶链式反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP),尽管只能做定性的分析,但通过条件优化,临床上可以作为一种初筛突变的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测人类EGFR基因19号外显子突变的引物组合物。本发明的另一个目的是提供一种利用上述的引物组合物制备的试剂盒,以及该试剂盒在检测非小细胞肺癌药物疗效相关的
EGFR基因19号外显子突变中的应用。本发明的又一个目的是提供一种检测人类EGFR基因19号外显子突变的方法,该方法利用本发明提供的试剂盒进行检测,检测耗时少、灵敏度高、特异性好、检测结果判读容易、明晰。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的
一种用于检测人类EGFR基因19号外显子突变的引物组合物,是由具有如下所述的核苷酸序列的引物组成
5,-TAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA-3,SEQIDNo:l,5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTA-3’SEQIDNo:2,禾口
5‘-ACACAGCAAAGCAGAAACTCACA-3‘SEQIDNo3。该引物组合物包括用于检测EGFR基因19号外显子突变的引物,其中用于检测EGFR基因19号外显子的上游引物核苷酸序列为SEQIDNO:1,下游引物核苷酸序列为SEQIDNO:3,另外包含一条EGFR基因19号外显子内部的上游引物SEQIDNO:2。一种试剂盒,至少包括上述的引物组合物和PCR反应液。作为优选,-HCl40mM,MgCl21524mM,KCl50mM,(MM)2SO410mM,,;所述的引物组合物包括各IOyMWSEQIDNo:1和SEQIDNo2所示的引物,以及20μM的SEQIDNo:3所示的引物。本发明还提供一种所述的试剂盒在检测非小细胞肺癌药物疗效相关的
EGFR基因19号基因外显子突变中的应用。所述的药物为Iressa(易瑞沙)或Tarceva(特罗凯)。本发明的试剂盒用于辅助临床医生诊断出可受益于Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)等特效药的肺癌患者,适合于非小细胞肺癌患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用,可为病者个体用药提供用药科学依据,降低治疗风险以及患者负担。一种检测人类EGFR基因19号基因外显子突变的方法,包括以下步骤(1)待测样本处理和模板DNA提取;(2)使用本发明所述的试剂盒对步骤(1)得到的DNA进行半巢式PCR扩增;(3)检测步骤(2)所得到的PCR扩增产物。作为优选,步骤(1)中的样本为手术切除的新鲜病理组织、石蜡包埋病例组织、全血、血浆、血清或胸腔积液。作为优选,步骤(3)中的检测方法为微流体芯片检测法。作为优选,本发明的检测方法与微流体芯片检测法相结合,具体包括以下步骤
(1)用本发明所述的引物组合物对被测样本的DNA进行半巢式PCR扩增,纯野生型、纯突变型和杂合突变型的扩增产物不同;
(2)扩增产物通过微流体芯片进行检测;
(3)通过对各检测峰的数量及检测峰位置的判断,确定检测到的片段数量及大小,从而确定被检测的基因,判断临床样本EGFR基因19号外显子的突变情况;
(4)结果判断a)仅出现149bp和98bp两个PCR扩增产物,说明临床样本的
EGFR基因19号外显子未出现突变情况,为纯野生型;b)出现149bp和98bp两个PCR扩增产物,以及其他两个条带,说明临床样本的EGFR基因19号外显子发生部分突变。本发明以人类EGFR基因19号外显子突变为检测对象,利用特异引物组的半巢式PCR反应,通过对PCR产物进行微流体芯片检测,实现快速、简单、准确、敏感的诊断人类EGFR基因突变。与现有的检测方法和试剂盒相比,本发明具有以下优点
(1)本发明采用PCR—SSCP(聚合酶链式反应一单链构象多态性分析)方法,定向对人类EGFR基因19号外显子缺失突变进行检测,与微流体芯片检测法的结合,具有灵敏度高、速度快、结果直观、可信性好的优点。(2)本发明的检测方法与微流体芯片检测法联合,具有自动化程度高、人机界面良好的优点,避免了诸多人为因素所带来的误差,所需时间和费用远远低于常规测序技术,符合临床上的需要。
图1为EGFR基因19号外显子纯野生型DNA样品的微流体芯片检测图。图2为EGFR基因19号外显子突变型DNA样品的微流体芯片检测图。图3为EGFR基因19号外显子突变型的基因测序图。
具体实施例方式以下参照具体的实施例及附图来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。以下实施例中所使用的技术,除非特别说明,均为本领域的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂等,除非是本说明书特别说明,均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。本发明所述的
“PCR”是指聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR),是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环,使目的DN***段得到扩增的一项分子生物学技术。本发明微流体芯片检测法使用的检测仪器是宁波基内生物技术有限公司生产的AMA2100型全自动微流芯片分析仪,、、、、、。实施例1待检测EGFR突变位点的确定
根据有关的NSCLC患者EGFR突变研究报道(文献来源董强刚、韩宝惠,晚期肺癌血清游离DNA中EGFR外显子19的基因突变研究,中华肿瘤杂志,2006,1:59-61),发现EGFR基因19号外显子基因常见的突变类型如表1所示。表1EGFR基因19号外显子基因突变类型
权利要求
,其特征在于其是由具有如下所述的核苷酸序列的引物组成5’-TAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA-3‘SEQIDNo:l,5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTA-3’SEQIDNo:2
,禾口5’-ACACAGCAAAGCAGAAACTCACA-3’SEQIDNo:3。
,其特征在于至少包括如权利要求1所述的引物组合物和PCR反应液。
,-HCl40mM,MgCl21524mM,KCl50mM,(MM)2SO410mM,,;所述的引物组合物包括各10μM的SEQIDNo:1和SEQIDΝο:2所示的引物,以及20μΜ的SEQIDΝο:3所示的引物。
。
,其特征在于包括以下步骤(1)待测样本处理和模板DNA提取;(2)使用权利要求2或3所述的试剂盒对步骤(1)得到的DNA进行半巢式PCR扩增;(3)检测步骤(2)所得到的PCR扩增产物。
,其特征在于步骤(1)中的样本为手术切除的新鲜病理组织、石蜡包埋病例组织、全血、血浆、血清或胸腔积液。
,其特征在于步骤(3)中的检测方法为微流体芯片检测法。
-7中任一项所述的方法,其特征在于包括以下步骤(1)用权利要求1所述的引物组合物对被测样本的DNA进行半巢式PCR扩增,纯野生型、纯突变型和杂合突变型的扩增产物不同;(2)扩增产物通过微流体芯片进行检测;(3)通过对各检测峰的数量及检测峰位置的判断,确定检测到的片段数量及大小,从而确定被检测的基因,判断临床样本EGFR基因19号外显子的突变情况;(4)结果判断a)仅出现149bp和98bp两个PCR扩增产物,说明临床样本的EGFR基因19号外显子未出现突变情况,为纯野生型;b)出现149bp和98bp两个PCR扩增产物,以及其他两个条带,说明临床样本的EGFR基因19号外显子发生部分突变。
全文摘要
本发明属于生物技术领域和医学领域,具体地,本发明涉及一种用于检测人类EGFR基因19号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法。该引物组合物包括用于检测EGFR基因19号外显子突变的引物,其中用于检测EGFR基因19号外显子的上游引物核苷酸序列为SEQIDNO1,下游引物核苷酸序列为SEQIDNO3,另外包含一条EGFR基因19号外显子内部的上游引物SEQIDNO2。本发明以人类EGFR基因19号外显子突变为检测对象,利用特异引物组的半巢式PCR反应,通过对PCR产物进行微流体芯片检测,实现快速、简单、准确、敏感的诊断人类EGFR基因突变。