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专利名称:用于人类肿瘤基因治疗的重组腺病毒载体的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种人类肿瘤的基因治疗方法。特别涉及带有人类肿瘤特异抗原编码基因的缺陷性重组病毒,以及其在治疗或预防人类肿瘤中和在体外或离体产生特异CTL的应用。还涉及含有这些病毒的药物组合物,特别是可注射形式的。
基因治疗就是通过向受累细胞或器官中引入遗传信息来校正缺陷或异常。这种信息可以在体外导入取自器官的细胞,然后再注回机体,也可以在目标组织中直接体内导入。作为高分子量并带负带荷的分子,DNA难于自动跨越磷脂细胞膜。因而为了转移基因使用了不同的载体一方面是病毒载体,另一方面是天然或合成的化学和/或生化载体。化学或生化载体例如是通过与DNA形成沉淀起作用的阳离子(磷酸钙、DEAE-葡聚糖等),所形成的沉淀可被细胞吞噬。还有脂质体,其中导入了DNA,并与浆膜融合。基因转移的合成载体一般是与DNA复合并形成表面带阳离子的粒子的带阳离子脂类或聚合物。这些粒子能与细胞膜的阴性电荷相作用,然后穿过它。作为这种载体的例子可举出二(十八烷酰基)氨基甘氨酰精胺(DOGS,TransfeetamTM)或N-〔1-(2,3-二油酰氧基)丙基〕-N,N,N-氯化三甲铵(DOTMA,LipofectinTM)。还开发了嵌合蛋白它们由聚集
DNA的多阳离子部分和与其连接的配体组成,所述配体固定在一种膜受体上并引起复合物通过细胞摄粒作用进入细胞内。理论上也可能“靶向”某种组织或某些细胞群,以改善所转移基因的体内生物利用度(综述见Behr,1993,Cotten和Wagner,1993)。在可能用作基因转移载体的病毒中,特别可举出逆转录病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺相关病毒和腺病毒。这些病毒都已用于感染不同类型的细胞。
为治疗不同的疾病已发展了基因治疗途径,包括神经系统疾病、心血管疾病或癌症。特别在癌症领域,现有技术中已提出了不同的途径。例如,有些研究描述了在白介素2存在下离体培养或用白介素2基因转染而活化的淋巴细胞的应用。免疫治疗研究也已采用纯化并离体用干扰素活化的单核细胞-巨噬细胞,以提高其杀肿瘤能力,然后再注回患者体内(Amdressen等,癌症研究(CancerRes.)50(1990)7450)。还描述(WO95/06120)了使用遗传修饰巨噬细胞的可能性。另一系列途径是基于能直接或间接诱发癌细胞死亡的毒性基因的转移。对于这种途径,例如已描述了胸苷激酶基因,通过腺病毒载体(PCT/FR94/01284;PCT/FR94/01285)或通过移植腺病毒载体生产细胞进行体内转移(Caruso等,PNAS90(1993)7024)。所用的其他基因例如是胞苷脱胺酶的基因。
本申请涉及新的癌症治疗方法。该方法特别用于治疗人类肿
瘤,特别是黑素瘤。本发明方法是基于人类肿瘤如黑素瘤的特异抗原的转移和体内表达,该抗原能够诱导(ⅰ)对抗这类癌出现的免疫保护和(ⅱ)对带有这些抗原的细胞特异的细胞毒性T细胞群(CTL)的扩增,和由免疫系统对相应肿瘤细胞的破坏。
除其他功能外,免疫系统能够保证抗病毒感染的保护作用。这种能力由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)保证实现。CTL具有两个显著特征它们特异性高且效力高。在定向于细胞表面的病毒抗原后,它们催毁那些被感染细胞。所述抗原表现为与Ⅰ类主要组织相容性复合物(MHC-Ⅰ)的一种分子相结合的肽形式。对于肿瘤,已观察到(最初在小鼠中)恶性细胞带有肽-MHC-Ⅰ分子复合物,如同在抗病毒应答中那样,这些复合物能够激发CTL介导的免疫应答。这些肽特别来自选择性地在肿瘤细胞中突变或活化的基因所编码的蛋白。这些蛋白被称为肿瘤特异性抗原。最近已在人肿瘤上鉴定出被CTL所识别的区别抗原。
本发明涉及一种治疗人类肿瘤的新方法。本发明特别在于提供了能够转移并在体内表达人肿瘤或黑素瘤特异性抗原的病毒载体。本发明特别基于在鼠模型中证明了这些缺陷性重组腺病毒能够诱导对抗这种抗原的免疫,使得在体内获得抗这些抗原特别是带有这些抗原的肿瘤细胞的淋巴细胞应答。因而本发明的这种方法能通过这些基因的转移特别有效地作用于人肿瘤的发展,即阻止其生长,并能够将其导向消亡。
本发明的第一个目的是一种缺陷性重组腺病毒,在其基因组中插有编码肿瘤特异性蛋白或肽特别是编码黑素瘤特异性抗原的部分或全部的核酸。
优选的是人黑素瘤的一种特异性抗原。更优选人黑素瘤特异抗原的这样的片段,其含有与MHC-Ⅰ分子结合呈递给CTL的那部分。人肿瘤的这些特异性抗原已由ThierryBoon等描述过(US5342774;US5405940;WO92/20356;WO94/23031;WO94/21126)。用术语MAGE表示的这些抗原选择性地在肿瘤细胞中表达,一般是人类肿瘤中。已描述了不同的人MAGE基因,特别是基因MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、MAGE-7、MAGE-8、MAGE-9、MAGE-10、MAGE-11、MAGE-12。作为鼠同类基因的代表,还可提到基因S-MAGE-1和S-MAGE-2。其他相关基因族的代表特别有基因BAGE、GAGE和RAGE。
根据一个优选的实施方案,本发明涉及一种缺陷型重组腺病毒,在其基因组中插有编码选自蛋白Mage-1、Mage-3、Bage、Gage和Rage的蛋白或从中衍生的肽的核酸。这些抗原实际上是选择性最好的,即它们在任何非肿瘤体细胞上不能被检测到的几率最大。抗原mage-1及相应基因的序列已特别在VanderBraggen等,科学(Science254(1991)1644)中被描述。编码Mage-1和Mage-3的cDNA序列已例如在Gaugler等(实验医学杂志(.)179(1994)921)中被描述。
如上文所指出的,本发明的一个优选实施方案中是一种缺陷性重组腺病毒,在其基因组中插有编码蛋白Mage-1、Mage-3、Bage或Gage的一种肽的核酸,所述肽包含与MHC-Ⅰ分子结合呈递给CTL的部分。Mage、Bage和Gage基因实际上编码很大的蛋白。这些蛋白在细胞内经酶消化而降解,导致肽的产生。正是这些肽随后被呈递在细胞表面,并与MHC-Ⅰ分子结合被CTL所识别(参见图2)。更优选地,本发明涉及一种缺陷型重组腺病毒,在其基因组中插有编码Mage-1或Mage-3蛋白的含有呈递给CTL那部分的肽的核酸。
根据一种具体实施方案,本发明涉及一种重组腺病毒,。该序列含有被HLA·Al分子呈递给细胞毒性T淋巴细胞的Mage-1九肽的编码序列(27bp)。-82残基间的序列。
根据另一具体实施方案,本发明涉及一种重组腺病毒,。该序列含有被HLA·Al分子递呈给细胞毒性T淋巴细胞的Mage-3九肽的编码序列(27bp)。
根据另一具体实施方案,本发明涉及一种重组腺病毒,在其基因组中插入了编码DBA/2小鼠p815肥大细胞瘤P1A基因的抗原肽的核酸()。
如前文所提到的,本发明的腺病毒可用于这些抗原肽的有效转移和体内表达。因此,它们能用于非常显著地刺激体内出现这些抗原的特异性细胞毒性
T淋巴细胞,后者选择性摧毁在其表面带有该抗原的所有细胞。
本发明的病毒因而可用于制备用于治疗其细胞表面带有Mage抗原的癌症的药物组合物。为制备这样的组合物,优选采取并分析病人的肿瘤细胞(一般是黑素瘤细胞)以(ⅰ)通过例如RT-PCR确定Mage基因的表达,及(ⅱ)必要时确定该Mage抗原的类别。构建含有编码相应抗原之全部或部分的核酸的腺病毒,然后用于给药。
本发明的病毒还可用于体外(或离体)产生给定肿瘤抗原的特异细胞毒性细胞群。为此,用本发明的病毒感染细胞群,然后与CTL细胞的前体接触。然后可在体外筛选并扩增抗原特异性CTL细胞,并用作药物以特异性摧毁相应的肿瘤。用本发明病毒感染的细胞群最好含有抗原呈递细胞(APC),特别是巨噬细胞(WO95/06120)或B细胞。
在本发明的腺病毒中,所插入的核酸可以是互补DNA(cDNA)片段、基因组DNA(gDNA)片段或一种杂合构建体,例如由其中插入一个或多个内含子的cDNA组成。还可以是合成的或半合成的序列。如前文所提到的,使用编码选自Mage-1、Mage-3、Bage和Gage的蛋白或从该蛋白衍生的肽的核酸。在本发明的意义上,衍生自该蛋白的肽这一术语指所述核酸可只编码该蛋白一个片段,该片段应能用于产生CTL。因而本发明的片段至少含有被特异
CTL识别的抗原决定簇。这些片段可通过本领域技术人员已知的任何方法获得,特别是通过遗传修饰和/或化学修饰和/或酶修饰,或者通过克隆和表达,同时根据其生物活性筛选变体。遗传修饰包括抑制、缺失、突变等。
所插入的核酸优选为cDNA或gDNA。
一般,所插入的核酸还含有允许抗原或抗原片段在被感染细胞中表达的序列。当天然负责所述抗原表达的序列在被感染细胞中有功能时,可以用这些天然序列。还可以使用不同来源的序列,称为异源序列(负责其他蛋白的表达,或甚至是合成的)。特别可使用特异或非特异可诱导或非可诱导地刺激或抑制基因转录的真核基因或病毒基因的启动子或其衍生序列。例如可使用来自待感染基因组或来自病毒基因组的启动子序列,特别是腺病毒E1A、MLP基因的启动子、CMV、LTR-RSV、SRα启动子等。对于真核细胞启动子,还可举出遍在型启动子(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间丝启动子(结蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)、治疗基因的启动子(MDR、CFTR、第八因子类等),组织特异启动子(丙酮酸激酶,绒毛蛋白,脂肪酸结合肠蛋白的启动子,平滑肌细胞α肌动蛋白的启动子,肝特异性启动子;ApoAⅠ,ApoAⅡ,人白蛋白等)、或应答于某种刺激的启动子(类固醇激素的受体,视黄酸受体)。另外,表达序列可通过加入活化序列、调节序列等来修饰。另外,当插入的核酸不包含表达序列时,这种核酸可插入在缺陷病毒基因组中这种表达序列的下游。
本发明的病毒是缺陷型的,即不能在靶细胞中自主复制。一般,本发明中所用的缺陷病毒的基因组缺失甚少所述病毒在感染细胞中复制所必需的序列。这些区域可被消除(全部或部分),或被致无功能,或被其他序列取代,特别是被插入基因取代。但优选这种缺陷病毒保留其基因组中病毒粒子衣壳化所必需的那些序列。
本发明的病毒可以从不同血清型的腺病毒获得。存在几种不同血清型的腺病毒,其结构和特性有所区别。这些血清型中,本发明中优选使用2型或5型的人腺病毒(Ad2或Ad5)或源自动物的腺病毒(见申请WO94/26914)。在可用于本发明的源自动物的腺病毒中,可举出源自狗、牛、鼠(如Mavl,Beard等,病毒学(Virology75(1990)81)、羊、猪、禽或猴(如SAV)的腺病毒。优选,源自动物的腺病毒是狗腺病毒,更优选腺病毒CAV2(如manhattan株或A26/61(ATCCVR-800))。优选,在本发明中使用来源于人或狗或混合来源的腺病毒。
优选地,本发明的缺陷腺病毒含有ITR、一种衣壳化序列和目的核酸。更优选,在本发明腺病毒的基因组中,E1区至少是非功能性的。所考虑的病毒基因可通过本领域技术人员已知的任何技术使其失去功能,特别是通过完全抑制、取代、部分缺失或在所考虑的基因中加入一个或多个碱基。这种修饰可在体外
(对分离的DNA)或就地完成,例如通过基因工程技术、或通过用诱变剂处理。其他区也可以被修饰,特别是E3区(WO95/02697)、E2区(WO94/28938)、E4区(WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697)和L5区(WO95/02697)。根据一种优选的实施方案,本发明的腺病毒包括在E1和E4区中的缺失。根据另一优选的实施方案,包括E1区中的缺失并在该部位插入E4区和目的核酸(参见CR9413355)。最好,E1区中的缺失范围为454-3328核苷酸(PvuⅡ-BglⅡ片段)或382-3446核苷酸(HinfⅡ-Sau3A片段)。E4区中的缺失最好至少为ORF3和ORF6。
目的核酸被插入在腺病毒基因组的不同区域中。腺病毒基因组由长约36kb的线性双链DNA组成。它特别包括在每个末端的反向重复序列(ITR)、衣壳化序列(Psi)、早期基因和晚期基因(参见图1)。主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4区中。其中包含在E1区中的基因是病毒增殖所必需的。主要的晚期基因包含在L1至L5区中。腺病毒Ad5的基因组已被完全测序并可从数据库中得到(特别见GenbankM73260)。同样,其他腺病毒(Ad2,Ad7,Ad12等)基因组的部分甚至全部也已被测序。目的核酸优选插入在缺陷性重组病毒的产生非必需的区域中。例如,优选插入在E1区中,该区在本发明病毒中是缺陷的而被生产细胞等所补充;插入在E3区中,该区对重组病毒的生产不是必需的
(其失活不应被反式补充);或插入在E4区中。对于E4的情形,在生产时需要补充E4功能,可通过用辅助质粒或病毒共转染来补充,或借助于适当的细胞系来补充。当然可以使用其他位点。特别是,对于基因组核苷酸序列的了解使本领域技术人员能鉴别出可插入目的核酸的区域。
可用本领域技术人员已知的任何技术制备本发明的缺陷性重组腺病毒(Levrero等,基因(Gene)101(1991)195,EP185573;Graham,(1984)2917)。一般,这些腺病毒是通过重组病毒DNA转染到能衣壳化的细胞系中制得的。这可以是一种简单转染,即当得到带重组病毒整个基因组的构建体时,或者更经常的是带有重组病毒基因组不同部分的多个DNA片段的共转染。此时,该方法涉及不同的构建体在衣壳化细胞系中的一步或多步同源重组,以产生重组病毒DNA。可按不同的方法制备用于生产病毒的不同片段。所用的最普遍的技术是分离病毒DNA,然后用生物生物学常规方法(消化、连接等)体外修饰之。随后纯化所得构建体并用于转染衣壳化细胞系。另一技术基于带重组病毒部分基因组的质粒的使用,其与带有基因组所缺部分的病毒共转染。另一种可能是使用原核细胞质粒制备可用于转染的病毒DNA(参见Bett等,PNAS91(1994)8802;FR9501632)。
优选所用的细胞系应(ⅰ)能被所述元件转化,和(ⅱ)带有能补