文档介绍：研究生细胞生物学实验(2)
一、原代细胞培养及活力鉴定:
内容:
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实验所需(每组):
小鼠孕鼠1只,75%酒精1瓶,大烧杯一个,饭盒1个(内有:大剪刀2把,大镊子2个,眼科剪刀2把,眼科镊子2把),一次性培养皿4个,D-hank’s液(含双抗)50ml,%胰酶10ml,DMEM培养基(含10%血清)20ml,50ml离心管2个,T25培养瓶1个,移液器一套(1000ul、200ul、10ul),灭菌Tip头一套(1000ul、200ul、10ul),%,血细胞计数板1个,计数板专用盖玻片2个,。
实验方法:
1、高压消毒取材用器材:剪刀(包括眼科剪)数把、镊子(包括眼科镊子)数把。
2、断颈处死孕第13天的孕鼠,无菌条件下取出条状子宫,放入含有PBS液的平皿内。
3、分离每一个胚胎,祛除表面胎膜,在D’hanks液内漂洗后转入另一个新的放有PBS液的平皿内。
4、祛除头、四肢、尾巴和内脏,清洗体壁,尽可能祛除血细胞,然后,用剪刀剪碎体壁成
1mm3的小块,加入trypsin(大约每个胚胎 1-2ml), 室温或37°C 消化15min,每5分钟轻轻晃动一次。待上清浑浊,组织块消化到很小时,吸取上清到50ml离心管内,用血清终止消化。然后,离心,1500rpm离心10分钟。弃上清,将沉淀洗涤2遍,待接种。
5、制备MEF培养基:高糖DMEM,10% (v/v) FCS,1/100 (v/v)青链霉素。
6、将上述制备好的细胞种植于T25培养瓶,用MEF培养基培养,种植密度为1x105/ml。将培养瓶放于370C,5%CO2孵箱进行培养,此即为0代。每日观察,隔天换液。待细胞呈80-90%汇合时,进行消化传代。
二、细胞的浸润与转移:
内容:
实验所需(每组):
贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞,细胞浸润实验24孔板专用的transwell(孔径6-8um、单个装)个,%明胶1ml,24孔板1个,PBS液(含双抗)50ml,%胰酶10ml,肿瘤细胞培养基20ml,血清3ml,15ml离心管2个,移液器一套(1000ul、200ul、10ul),灭菌Tip头一套(1000ul、200ul、10ul),,棉棒1包,结晶紫染液1ml。
实验方法:
用无菌200ul tip头在培养有肿瘤细胞的24孔板中轻轻划一道直线(划掉细胞为准),更换无血清培养基,培养24小时后观察。
2. transwell实验
1)%明胶包被。
2)将具有侵袭能力的肿瘤细胞胰酶消化,无血清培养液重悬。
3)24孔板每孔下室中加入含10% 血清(作为趋化剂)的培养液;上室中立即加入无血清培养液重悬的细胞悬液。
4)将24孔板放入培养箱中常规培养。24小时后以无菌棉棒轻轻揩去上室残留细胞后,用4%的多聚甲醛固定上室底面的细胞,室温放置10min。蒸馏水洗涤。
5)蒸馏水洗去固定液后,结晶紫染色10 min。蒸馏水冲洗后观察拍照。
三、细胞