文档介绍：第二代DNA测序技术
的末端的标记来确定DNA的序列。
概述
主流。
1、454 FLX的测序片段比较长,高质量的读长(read)能达到400bp;
2、Solexa测序性价比最高,不仅机器的售价比其他两种低,而且运行成本也低,在数据量相同的情况下,成本只有454测序的1/10; 3、SOLID测序的准确度高,%,%
,是目前第二代测序技术中准确度最高的。
基本原理
得待测DNA的序列信息。
操作流程
1)测序文库的构建(
Library Construction)
然后加上接头(或者先将RNA反转成cDNA,然后再片段化并加上接头)。片段的大小(Insert size)对于后面的数据分析有影响,可根据需要来选择。对于基因组测序来说,通常会选择几种不同的insert size,以便在组装(Assembly)的时候获得更多的信息。
2)锚定桥接(Surface Attachment and Bridge Amplification)
Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行,flow cell又被细分成8个Lane,每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构,以供后续的预扩增使用。
3)预扩增(Denaturation plete Amplification)
添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增,单链桥型待测片段被扩增成为双
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链桥型片段。通过变性,释放出互补的单链,锚定到附近的固相表面。通过不断循环,将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
4)单碱基延伸测序(Single Base Extension and Sequencing)
在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增,在每一个测序簇延伸互补链时,每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光,测序仪通过捕获荧光信号,并通过计算机软件将光信号转化为测序峰,从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling,Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响,如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加,错误率也会随之上升。
5)数据分析(Data Analyzing)
这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分,但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列,要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架,或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上,并进一步分析得到有生物学意义的结果。
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高通量测序
又称“下一代”测序技术,以能一次并行对几十万到几百万条