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专利名称:选择性标记基因的制作方法
技术领域:
本发明涉及基因重组技术中有用的选择性标记及其利用。详细言之,本发明涉及转化丝状真菌时可应用的选择性标记——编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因,含该基因的载体,用该载体转化丝状真菌而得的转化体,及利用该转化体的蛋白质的生产方法。
背景技术:
以米曲霉为主的曲霉属自古以来广泛用于发酵食品或各种有用物质的生产等,通过这么多年的检验其安全性得到评价,所以近年来通过基因重组技术作为有用蛋白质的宿主被广泛应用。
在工业上使用的曲霉属丝状真菌的育种中,为了赋予所期望的特性,使用基因工程学技术是非常有效的。基因工程学技术中,为了有效筛选获得了所期望特性的转化体,选择性标记是必要的。
已经报道的丝状真菌用的选择性标记有耐药性基因,例如潮霉素B抗性基因(;56(1)117-24)和吡啶硫***素抗性基因(BiosciBiotechnolBiochem,64(7)1416-1421(2000);特开2000-308491号公报),或者表现营养缺陷型基因,例如argB((9),2549-2555,
1987)、niaD(Gene111(2),149-55,1992Feb15)或pyrG((3),159-163,1989)等。
发明公开通常,工业上利用具有抗生素耐药基因的微生物时,伴随着抗生素耐药基因扩散到人类生活圈的危险,所以优选应用以营养缺陷型为指标的选择性标记。但是,现在利用的以营养缺陷型为指标的选择性标记的种类有限,在研究进程中可选择性很小,某些情况下营养缺陷型不稳定,或标记的选择性不够好,所以殷切希望开发出以营养缺陷型为指标的新型丝状真菌用的选择性标记。
由此,本发明的课题是提供转化丝状真菌时可应用的、以营养缺陷型为指标的选择性标记基因。本发明还以提供该选择性标记基因的具体使用方式-含选择性标记基因的载体,用该载体转化丝状真菌而得的转化体,及利用该转化体的蛋白质的生产方法为课题。再者,以提供缺失上述选择性标记基因的丝状真菌为课题。
为了解决上述课题,本发明者们进行各种探索。首先,对米曲霉IF030113株(财团法人发酵研究所)实施突变处理后,分离出呈现营养缺陷型的突变株,对其营养缺陷型进行详细研究。结果表明该突变株是尼克酸缺陷型,推测其原因是由于喹啉酸磷酸核糖基转移酶的缺损造成的。然后,成功克隆了编码米曲霉喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因,用整合了该基因的质粒转化缺失了该基因的丝状真菌时,转化体不显示尼克酸缺陷,由此可以确认可利用该基因作为丝状真菌用的选择性标记。
本发明就是基于以上发现而完成的,本发明提供以下构成。
包含以下(1)、(2)或(3)的DNA的选择性标记(1)包含序列表中序列号1所示碱基序列的DNA;(2)在严紧条件下与包含序列表中序列号1所示碱基序列的DNA杂交,且编码具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的蛋白质的DNA;(3)由包含序列表中序列号1所示碱基序列中1或数个碱基发生置换、缺失、插入、附加或逆位的碱基序列,且编码具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
一种重组载体,它包含[1]中的选择性标记。
用[2]中的重组载体进行转化而形成的丝状真菌转化体。
一种转化体的制备方法,其特征在于,用含[1]中选择性标记的重组载体转化缺失了喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的丝状真菌,以尼克酸或尼克酰***缺陷为指标筛选转化体。
一种蛋白质的生产方法,它包括用包含[1]中选择性标记和编码目的蛋白质基因的载体转化缺失了喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的丝状真菌的步骤;以尼克酸或尼克酰***缺陷为指标筛选转化体的步骤;在可能产生上述目的蛋白质的条件下培养筛选出的转化体的步骤;回收产生的蛋白质的步骤。
一种米曲霉(Aspergillusoryzae)属的丝状真菌,其特征在于,它缺失了编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因。
一种重组载体,它包含作为选择性标记的丝状真菌来源的喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因。
一种转化体的制备方法,其特征在于,用[7]中的重组载体转化缺失了喹啉酸磷酸核糖基转移酶的丝状真菌,以尼克酸或尼克酰***缺陷为指标筛选转化体。
一种蛋白质的生产方法,它包括用包含丝状真菌来源的喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因和编码目的蛋白质基因的载体转化缺失了喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的丝状真菌的步骤;以尼克酸或尼克酰***缺陷为指标筛选转化体的步骤;在可能产生目的蛋白质的条件下培养筛选出的转化体的步骤;回收产生的蛋白质的步骤。
实施发明的最佳方案以下对本发明的构成进行详细说明。本发明涉及选择性标记,包含序列表中序列号1所示碱基序列。所述DNA是编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因,可用以下方法获得。
<1>编码米曲霉的喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的分离(1)米曲霉尼克酸缺陷型菌株的获得编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因可以从米曲霉(例如IF030113株(财团法人发酵研究所))的染色体文库中分离出来,如通过应用以与喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因同源性高的EST序列为基础制备的引物进行PCR反应,或以上述PCR引物作探针进行杂交分离。另外,可用米曲霉的染色体DNA文库或应用表达载体的
cDNA文库转化米曲霉的尼克酸缺陷型突变株,筛选尼克酸缺陷型互补的转化体,从转化体中回收重组DNA,从而获得编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因。
所得DN***段是否编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶可通过,例如用该DN***段转化显示尼克酸缺陷型的宿主,检测转化体尼克酸缺陷型是否恢复来进行验证。
米曲霉的尼克酸缺陷型突变株的获得可用UV等进行突变处理,使米曲霉孢子的生存率达百分之几,从在基本培养基中不能生长的菌株中筛选显示尼克酸缺陷型的菌株。或者,将预先导入了使基因不表达的突变的喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因导入不显示尼克酸缺陷型的米曲霉中,使之与染色体上的喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因发生同源重组而获得。
通过联合应用上述选择性标记基因与丝状真菌,可提供以营养缺陷型为指标的新型转化体的筛选方法。
(2)选择性标记基因的分离、鉴定(i)米曲霉染色体DNA文库的制备首先,从米曲霉(例如IF030113株(财团法人发酵研究所))中提取染色体DNA。可按常规方法提取染色体DNA,例如可采用TIG,10(7),226(1994)中记载的方法。
用适当的限制性酶(例如HindIII、EcoRI、EcoRV、PstI、BamHI、XhoI)酶切所得染色体DNA,用DNA连接酶连接到与适宜的载体(例如pUC119,宝酒造株式会社)所使用的与上述限制性酶对应的酶切位点。用所得重组载体转化宿主(大肠杆菌等
),从而制备染色体DNA文库。
所使用的载体只要是能在宿主内自主复制且具有选择性标记即可,具体而言,除质粒pUC119以外还包括pUC11g、pUC19、pBR322等。
为了制备含基因全长的染色体DNA文库,优选对预先用各种限制性酶消化的米曲霉的染色体DNA进行Southern杂交,优选用可检测出单一条带的限制性酶制备文库。
(ii)米曲霉喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的获得从米曲霉克隆编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因时,检索编码与已知的喹啉酸磷酸核糖基转移酶同源性高的蛋白质的碱基序列的EST克隆。EST克隆的检索可利用,例如米曲霉EST数据库()。参考检索出的同源性高的碱基序列,合成寡核苷酸。寡核苷酸的合成可应用例如商品化的DNA自动合成装置等进行。这里对寡核苷酸的长度无特殊限制,只要适于PCR即可。例如10~50个碱基长,优选15~30个碱基长。
接下来,以合成的寡核苷酸作引物,以米曲霉的染色体DNA为模板进行PCR,获得米曲霉喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的一部分。以此作探针,筛选(i)中制备的米曲霉染色体DNA文库,选择持有喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的克隆,由该克隆获得米曲霉喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因全长。
作为筛选的方法可根据染色体文库的特性应用集落杂交或噬斑杂交。具体而言,应用质粒及其宿主大肠杆菌制备染色体
DNA文库时,将大肠杆菌的集落转移到膜上,用上面获得的喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的一部分作探针,进行集落杂交。从所选的菌落中制备质粒,由此可获得整合了编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因的整合质粒。
(iii)分离出的DN***段(选择性标记基因)的分析插入到上面所得质粒中的DN***段(克隆DN***段)的碱基序列的测定可,例如用DeletionKitforKilo-Sequencing(TAKARA公司)制备系列缺失体,用ABIPRISM310GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems)进行测定。
用以上方法测定由米曲霉IF030113株获得的克隆DN***段(喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因)编码区域的碱基序列(序列号1)和该碱基序列所编码的氨基酸序列(序列号2)。
需要指出的是,因为到目前为止尚没有鉴定米曲霉喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的报道,所以具有测定出的基因序列的基因是新基因。
序列号1的序列经部分改变了的DNA(以下称作“经过修饰的DNA”)只要其编码的蛋白质具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性也可作为本发明的选择性标记利用。需要指出的是,这里对喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性水平没有特殊限定,但是考虑到作为选择性标记的功能,所以优选其活性尽可能的高。例如,优选与序列号1中序列构成的DNA所编码的蛋白质的喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性相同。
作为经过修饰的DNA的具体例包括,在严紧条件下与序列号1中的DNA序列杂交,且编码具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性蛋白质的DNA。需要指出的是,这里所讲“严紧条件”是指能形成所谓的特异性杂交,而不形成非特异性杂交的条件。例如,用杂交液(50%甲醛、10×SSC(,15mM柠檬酸钠,)、5×Denhardt溶液、1%SDS、10%硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液())42℃孵育,×SSC、%SDS68℃洗涤的条件。更优选的严紧条件可例举杂交液用50%甲醛、5×SSC(,15mM柠檬酸钠,)、1×Denhardt溶液、1%SDS、10%硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液()的条件。
作为经过修饰的DNA的其它例子,包括由序列号1中所示碱基序列中1到数个碱基发生置换、缺失、插入、添加或逆位的碱基序列构成、且编码具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性蛋白质的DNA。碱基置换等突变可在多个位点发生。这里“多个”是指根据氨基酸残基在蛋白质立体构造中的位置和种类而异,可以是2~40个,优选2~20个,更优选2~10个。需要指出的是,这些突变中包含内含子部分的去除、5’末端3’末端或其它部位导入限制性酶切位点和添加编码信号肽的序列等。
作为具体例包括序列号3中所示的具有去除了内含子序列的DNA。
以上所示编码与喹啉酸磷酸核糖基转移酶基本上同一蛋白质的经过修饰的DNA,可以通过基因工程学技术进行修饰,例如用位点特异性突变法获得包含特定位点的氨基酸残基发生置换、缺失、插入、添加或逆位的编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的DNA。另外,也可通过紫外线处理持有喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因的丝状真菌,随后分离改变了的基因等众所周知的突变处理方法而获得。
需要指出的是,上述碱基置换、缺失、插入、添加或逆位等突变中,根据持有喹啉酸磷酸核糖基转移酶的微生物的个体差异、种和属间的差异等也包含天然产生的突变。
例如天然存在的丝状真菌(例如米曲霉)中有这样的改变了的DNA时,可以从丝状真菌中提取染色体DNA,用适当的限制性酶处理后,用序列号1的DNA或其一部分作探针进行筛选,筛选、分离出在严紧条件下与之进行杂交的DNA。另外,也可以应用染色体DNA文库,以序列号1的DNA或其一部分作探针,在严紧条件下进行筛选该文库中包括保持改变了的DNA的克隆。
用本发明的选择性标记基因可构建能用于转化丝状真菌的重组载体。也就是说,本发明的另一方面与具有上述选择性标记基因的重组载体有关。此处所述的质粒包括已经整合了编码预期蛋白质
(目的蛋白质)基因的质粒,也包括未整合上述基因的质粒。
以下具体阐述重组载体的构建方法。
<2>重组载体的构建转化丝状真菌的重组载体的构建可以通过,例如将上述选择性标记基因插入到可用于转化丝状真菌的商品化的载体的克隆位点上进行。通过将编码预期表达的蛋白质(以下叫做目的蛋白质)的基因插入到如此构建的载体中,可获得用于目的蛋白质的生产体系中的重组载体。这里对目的蛋白质的种类没有限制,例如包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶、纤维素酶、果胶酶等与糖相关的酶,凝乳酶等蛋白酶,脂酶等。另外,目的蛋白质可以是同种蛋白质也可是异种蛋白质。这里所讲同种蛋白质是指供转化的丝状真菌原本产生的蛋白质,异种蛋白质是指供转化的丝状真菌原本不产生的蛋白质,即通过外源导入编码该蛋白质的基因才开始产生的蛋白质。
这里,编码目的蛋白质的基因若已经包含在转化体中发挥功能的启动子时,可直接插入到载体中使用,例如与宿主的基因同源的基因。另一方面,无论异种基因或同种基因,若是不含启动子的基因时,通常有必要将在转化体中发挥功能的启动子连接到编码目的蛋白质区域的上游。
本发明中的“重组载体”包括当用它进行转化时,至少其一部分(例如编码目的蛋白质的基因及选择性标记基因)能整合到宿主的染色体中,及在宿主内能以质粒状态存在的载体。