文档介绍：树脂是工业中使用得比较广泛的材料,它价格低廉、机械强度好、物化性能稳定、容易再生,用作固定化酶的载体将会有很好的发展前景。离子交换树脂是一类不溶也不熔且具有三维空间网状骨架结构亲水性的功能高分子。连接在树脂骨架上的功能基,可通过吸附、共价键、离子键、配位键、交联、微胶囊等形式以及其他手段将酶固定在树脂上,构成固定化酶[65]。树脂D380是一种浅黄色球形大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上带有伯胺基,属于反应性高分子材料。该树脂表面的功能基团-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反应生成西弗(Schiff)碱,而戊二醛的另一个醛基可以连接酶蛋白中游离的-NH2,因此达到固定化酶的目的。

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气浴恒温振荡器 THZ-92B型
数显恒温水浴锅 HH-S型
电子分析天平 AB204-N型
紫外一可见光分光光度计 VIS-7220G
循环水真空泵 SHI-III型

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真菌漆酶>20u/mg
树脂 D380
戊二醛分析纯
邻联甲苯胺分析纯
醋酸分析纯
醋酸钠分析纯
碳酸氢二钠分析纯
碳酸二氢钠分析纯
氢氧化钠分析纯
盐酸分析纯

取一定量的树脂,去离子水浸泡24h,然后用5%HC L浸泡1 2h,洗涤至中性后再用2%的Na0H浸泡1 2h,再次洗涤至中性,最后以去离子水浸泡备用。

首先,采用两种方法路线固定化漆酶:先用戊二醛交联载体后再吸附漆酶和先用载体吸附漆酶后再用戊二醛交联,分别测定两种方法固定化漆酶的活力,。其中戊二醛浓度为2%(V:V),加入量为20mL,缓冲溶液为5 ,酶液为10mL浓度1 mg/mL的稀释酶液。实验结果表明前者效果明显优于后者,因此后续实验均采用此法进行。
漆酶的固定化方法:取适量预处理过的树脂,抽滤去除表面水分,称取1g置于50ml圆底烧瓶中,加入20ml %(V:V)的戊二醛,在4℃下搅拌反应2h后静置过夜,再用蒸馏水洗涤多次(至少5次),去掉未交联的戊二醛,然后加入5ml pH为4的醋酸一醋酸钠缓冲液和2mL稀释酶液在振荡器中在25℃振荡反应6h,反应后放在冰箱于4℃下静置一夜,洗涤多次(至少5次)去除未固定化的漆酶,并测定固定化漆酶酶活。
抽滤,洗涤多次
25℃,恒温振荡吸附
抽滤,洗涤多次
抽滤,洗涤多次
4℃水浴中搅拌反应
抽滤,洗涤多次
测定固定化漆酶活力,选择最佳方法,优化固定化条件
D380树脂的预处理
方法一
方法二
4℃水浴中搅拌反应
25℃,恒温振荡吸附
戊二醛溶液
缓冲液和
酶液

根据实验条件,本文以邻联甲苯胺做底物,采用紫外分光光度法测定该真菌漆酶的酶活力。自由漆酶活力的测定方法【7 2】:,加入各试剂于比色管中,在25℃的恒温水浴中保温30min,以煮沸灭活的方式终止反应,在VIS-7220G型紫外一可见分光光度计上按表1所示波长测定吸