文档介绍：生物医学工程专业优秀毕业论文---普鲁士蓝修饰的马脾铁蛋白的类酶活性及其在免疫组化检测中的应用
关键词:普鲁士蓝纳米颗粒过氧化物酶免疫组化类酶活性
摘要:生物酶在临床诊断、生物分析等领域都有重要的应用,虽然已经被广泛商品化,但是存在成本高、保存困难等缺点。纳米结构的模拟酶由于易于制备、成本低、稳定并且催化活性高,已经成为纳米研究领域中的一个热点。近年来,普鲁士蓝纳米颗粒(Prussianbluenanoparticles,PBNPs)在模拟酶领域受到了广泛的关注,由于具备较低的氧化还原电位和良好的电子传递能力,PBNPs被认为是一种高性能的人工模拟酶,从而在电化学生物传感器的组建中得到了广泛的应用。
铁蛋白(ferritin)是一种由24个单位结构相似的亚基自组装形成的纳米尺度的蛋白质,由外部的蛋白质壳层和内部的以水合氧化铁为主要成分的铁核组成。它是一种天然的纳米结构,具有特殊的生物功能。各种天然的铁蛋白(含铁)和重组铁蛋白(无铁)已经被使用作为模板来合成各种纳米颗粒,如磁性Fe3O4纳米颗粒、半导体CdS量子点、Au原子团簇、Pt纳米颗粒,等等。虽然人类、马、牛蛙和细菌等的铁蛋白在一级结构上有很大的差异,但是本质上它们拥有相同的体系结构,所以其他机体的铁蛋白应该和人类的铁蛋白具有相同的功能。研究发现,很多肿瘤细胞表面大量表达铁蛋白特异性受体,从而通过铁蛋白受体-铁蛋白的结合介导对铁蛋白的内吞作用。有报道指出,重链铁蛋白(HFt)的受体是转铁蛋白受体1(Transferrinreceptor-1,TfR-1),在肿瘤组织中,TfR-1的表达量远远高于健康组织及癌周组织,这就使得铁蛋白在肿瘤的诊断和治疗中有很大的应用潜力。
本文中,我们设计了一种新的基于天然铁蛋白模板的合成方法,无需去除内部氧化铁核。实验利用酸性条件下亚铁氰化钾在氧化铁核表面的沉积反应,从而得到了小尺寸的普鲁士蓝纳米颗粒同时保留了蛋白质壳的生物学特性。我们将这种复合结构命名为普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒(Prussianbluemodifiedferritinnanoparticles,PB-FtNPs)。
(1)通过温度、pH以及反应物比例的调控,实现了对PB-FtNPs的尺寸和形貌的控制,并确定了温度4℃、、亚铁氰化解/∶1为最佳合成条件。用紫外可见光吸收谱、TEM、DLS等进行表征,从而表明了普鲁士蓝的存在和蛋白质结构的完整。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedadsorptionassay,ELISA)证明了在PB-FtNPs中,蛋白质仍然具有特异性。对PB-FtNPs和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰过的普鲁士蓝纳米粒子的稳定性研究表明,PB-FtNPs更加稳定,这可能是由于蛋白质壳对普鲁士蓝的包覆作用。
(2)选取了分别带有正电荷和负电荷的色原底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS),以PB-FtNPs代替酶催化H2O2氧化色原底物从而引起颜色变化,验证了其具有过氧化物酶活性。米氏动力学分析结果表明,PB-FtNPs比尺寸相近的Fe3O4纳米粒子具有更强的催化能力(高1~2个数量级)。类酶活性对pH、温度和PB-Ft