文档介绍：孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业: 学号: 姓名: 分数:
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的与要求
掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,如乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540 nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。
三、实验材料、主要仪器和试剂
(1000 g)

(1)具塞玻璃刻度试管:20 mL×11 (2) 滤纸(3)烧杯:100 mL×2
(4)三角瓶:100 mL×1 (5)容量瓶:100 mL×3 (6)刻度吸管:1mL×1;2 mL×2;10 mL×1 (7)恒温水浴锅(8)煤气炉(9)漏斗(10)天平(11)分光光度计
3. 试剂
(1)1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100 mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂: g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000 mL容量瓶中,加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL,再加入45 g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000 mL。
(3)碘-碘化钾溶液:称取5 g碘和10 g碘化钾,溶于100 mL蒸馏水中。
(4)酚酞指示剂: g酚酞,溶于250 mL 70%乙醇中。
(5)6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。( mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL)
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
批阅教师: 年月日
取7支20 mL具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/mL葡萄糖标准液(mL)
蒸馏水(mL)
DNS(mL)
葡萄糖含量(mg)
光密度值(OD540nm)
0
0
2

0
 
1

 
2

 
3

 
4

 
5

 
6

 
将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5 min,取出,用冷水迅速冷却至室温,用蒸馏水定容至20 mL,加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540 nm,用0号管调零点,等后面7~10号管准备好后,测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。
葡萄糖含量(mg)
2. 样品中还原糖和总糖的测定
(1)还原糖的提取
g食用面粉,放入100 mL烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入50 mL蒸馏水,搅匀,置于50 ℃恒温水浴中保温20 min,不时搅拌,使还原糖浸出。过滤,将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,即为还原糖提取液。
(2)总糖的水解和提取
g食用面粉,放入100 mL三角瓶中,加15 mL蒸馏水及10 mL 6 M HCl,置沸水浴中加热水解30 min, 取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色,并定容到100 mL,过滤取滤液10 mL于100 mL容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液,用于总糖测定。
(3)显色和比色
取4支20 mL