文档介绍：该【实验十一蛋白质脱盐】是由【鼠标】上传分享，文档一共【6】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【实验十一蛋白质脱盐】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。实验十一???蛋白质脱盐?(透析和凝胶过滤)?在蛋白质的研究中,经常要进行蛋白质脱盐,即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。蛋白质脱盐的方法很多,各有优缺点。以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法,可根据实验条件和要求选用。?(一)蛋白质透析?一.?目的?学****透析的基本原理和操作。?二.?原理?蛋白质是大分子物质,不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质的过程中,常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。?三.?仪器、试剂、材料?1.?仪器?烧杯;玻棒;离心机;离心管;冰箱;电炉。?2.?试剂?1%***化钡溶液;硫酸铵粉末;1mol/L?EDTA;2%NaHCO3。3.?材料?透析管(宽约,长12-15cm)或玻璃纸;皮筋;鸡蛋清溶液:将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1:20混匀,然后用六层纱布过滤。?四.?操作方法?1.?透析管(前)处理:先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/L?EDTA溶液中,煮沸10分钟,再在2%?NaHCO3溶液中煮沸10分钟,然后再在蒸馏水中煮沸10分钟即可。?2.?取5ml蛋白质溶液于离心管中,加4g硫酸铵粉末,搅拌使之溶解。然后在4℃下静置20分钟,出现絮状沉淀。?3.?离心:将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。?4.?装透析管:离心后倒掉上清夜,加5ml蒸馏水溶解沉淀物,然后小心倒入透析管中,扎紧上口。?5.?将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中,进行透析,并不断搅拌。?6.?每隔适当时间(5-10分钟),用***化钡滴入烧杯的蒸馏水中,观察是否有沉淀现象。?五.?结果处理?记录并解释实验现象。六.?注意事项?1.?硫酸铵盐一定要充分溶解,才能使蛋白质沉淀下来。?七.?思考题?在透析袋处理过程中,?EDTA和NaHCO3起何作用????(二)凝胶过滤?一.?目的?学****凝胶过滤的基本操作技术,了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。?二.?原理?凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和聚丙烯酰***凝胶(Bio-gel-P)等。这些多聚高分子材料,通过适当浓度的交联剂作用即产生分子间横向的交联,形成具有一定孔径的网络结构。当用这类材料制成粒状凝胶颗粒后,颗粒内部就形成一种三维网状结构。这些凝胶材料是高度亲水的,在水溶液里吸水显着膨胀。实际工作中常用每克干胶吸水量(ml)的10倍(G值)表示凝胶的交联度,可根据被分离物质分子的大小和工作目的,选择适合的凝胶型号。当在柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时,自由通透的小分子可以进入胶粒内部,而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大,大分子只能沿着胶粒之间的间隙向下流动,所经路程短,最先流出。而渗入胶粒内部的小分子受迷宫效应影响,要经过层层扩散向下流动,所经路程长,最后流出。通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。?凝胶过滤的操作条件温和,适于分离不稳定的化合物;凝胶颗粒不带电荷,不与被分离物质发生反应,因而溶质回收率接近100%,而且设备简单、分离效果好、重现性好,凝胶柱可反复使用,所以广泛使用于蛋白质等大分子的分离纯化、分子量测定、浓缩、脱盐等用途。本实验利用凝胶过滤的特点,将(NH4)2SO4盐同蛋白质分子分离开。?????????????????????????三.?仪器、试剂、材料?1.?仪器?层析柱(ф2cm×15cm);真空泵;真空干燥器;恒流泵;核酸蛋白检测仪;部分收集器;记录仪。?2.?试剂?1%***化钡溶液;硫酸铵粉末;Sephadex?G-25。??3.?材料鸡蛋清溶液:将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1:20混匀,然后用六层纱布过滤。?四.?操作方法?1.?凝胶溶胀:取5?g?Sephadex?G-25,?加200ml蒸馏水充分溶胀(在室温下约需6小时或在沸水浴中溶胀5小时)。待溶胀平衡后,用倾泻法除去细小颗粒,在加入与凝胶等体积的蒸馏水,在真空干燥器中减压除气,准备装柱。?2.?装柱:将层析柱垂直固定,旋紧柱下端的螺旋夹,加入1/4柱长的蒸馏水。把处理好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀,然后边搅拌边倒入柱中,同时开启螺旋夹控制一定流量。最好一次连续装完所需的凝胶,若分次装入,需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶,以免出现界面影响分离效果。最后放入略小于层析柱内径的滤纸片保护凝胶床面。?3.?平衡:继续用蒸馏水洗脱,调整流量使胶床表面保持2cm液层,平衡20分钟。?4.?样品制备:取5ml蛋白质溶液于离心管中,加4g硫酸铵粉末,搅拌使之溶解。然后在4℃下静置20分钟,出现絮状沉淀。将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟,离心后倒掉上清夜,加5ml蒸馏水溶解沉淀物,即为样品。5.?上样:当胶床表面仅留约1mm液层时,吸取1ml样品,小心地注入层析柱胶床面中央,慢慢打开螺旋夹,待大部分样品进入胶床、床面上仅有1mm液层时,用乳头滴管加入少量蒸馏水,使剩余样品进入胶床,然后用滴管小心加入3-5cm高的洗脱液。?6.?洗脱:继续用蒸馏水洗脱,调整流速,使上下流速同步。用核酸蛋白检测仪检测,同时用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液,即为脱盐后的蛋白质溶液。?7.?用***化钡溶液检测蛋白质溶液,评价脱盐效果。?五.?结果处理?记录并解释实验现象,讨论凝胶过滤的脱盐效果。?六.?注意事项?1.?整个操作过程中凝胶必须处于溶液中,不得暴露于空气,否则将出现气泡和断层,应当重新装柱。?2.?加样时应小心注入床面中央,注意切勿冲动胶床。?七.?思考题?影响凝胶过滤脱盐效果的因素有那些?