文档介绍：动物肝脏中DNA的制备和鉴定
核酸的分类
DNA (脱氧核糖核酸)
主要存在于细胞核的染色体中。
核外也有少量DNA,如线粒体DNA(mtDNA),叶绿体DNA(cpDNA),质粒DNA。
RNA(核糖核酸)
存在于细胞质中,如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA,RNA外,还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体,其或只含DNA,或只含有RNA。
核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合,以复合物形式存在
微溶于水,不溶于乙醇,氯仿等有机溶剂
在酸性溶液中容易降解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
DNA溶液粘度很大,RNA的粘度较小
在强大离心力的作用下,可以从溶液中沉降下来
浓盐法:利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。
离子去污剂法:利用SDS、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)等去污剂使蛋白质变性,直接从生物材料中提取DNA。
苯酚抽提法:苯酚既是蛋白变性剂,又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。
基因组DNA的提取方法
核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷,结合带正电荷的蛋白质。用于
核酸提取的去垢剂,一般都是阴离子去垢剂。
去垢剂的作用:
,使细胞膜破裂;
,使其解聚,将核酸释放出来;
、DNase有一定的抑制作用。
如:SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘--二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠
作用:
、沉淀,从核酸提取液中分离除去,以防造成蛋白污染。
RNase活性和破裂细胞的作用。
如:苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
核酸制备中常用的酶
DNase:降解DNA
RNase:降解RNA
蛋白酶K:降解蛋白质
溶菌酶:破碎细胞
核酸提取的主要步骤
破碎细胞:研磨、组织匀浆、超声、冻融;异硫氰酸胍、碱裂解;酶解(溶菌酶)
除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子:酚/氯仿抽提、蛋白变性剂(SDS、异硫氰酸胍等)、蛋白酶处理、高盐洗涤
除去其它不需要的核酸分子
沉淀核酸,去除盐类,有机溶剂等杂质
注意事项
避免过酸、过碱及高温
加入DNA酶抑制剂:柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等
蛋白变性剂反应不宜过于剧烈
加入RNA降解酶除RNA
1、学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理。
2、学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。
一、实验目的: