文档介绍：PCR扩增实验
原理:
利用特异的引物,以重组质粒pGEX-4T-1(His)6-C-X为模板扩增X基因。
扩增反应
1)扩增引物
2)模板:重组质粒pGEX-4T-1(His)6-C-X
3)PCR反应试剂盒(购置)
4)50×TAE缓冲液: 242g Tris碱
冰醋酸
100ml EDTA
H2O补充至1000 ml
5)6×凝胶加样缓冲液:%溴酚兰,%二甲苯青FF,40%蔗糖,4℃保存
6)溴化乙锭保存液:10mg/ml,避光保存
7)%琼脂糖凝胶: ml 1×TAE。
1)按以下次序,:(100ul)
ddH2O 79ul
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物, 2ul ()
MgCl2 6ul ()
引物1 1ul (终浓度为50pmmol/L )
引物2 1ul (终浓度为50pmmol/L )
模板DNA 1ul
2)100℃加热反应混合液10分钟,冰浴5′,使DNA完全变性。
3)将1ulTaqDNA聚合酶(5单位/ul),加入反应混合液中。
4)用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上,防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发。
5)按以下方法进行PCR反应:
常用循环参数:①变性:94℃ 1分钟、②退火:55℃ 1分钟、③延伸:72℃ 1分30个循环。
6)%琼脂糖凝胶板:%琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却,倒入制胶槽中,充分凝固后拔出样品梳;
7)将凝胶板放人电泳槽,加入1×TAE缓冲液,使液面略高于凝胶。
8)从反应混合液中取出DNA扩增产物2 ul并加1ul 6×凝胶加样缓冲液,混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳。
9)电泳100V约1小时;
10)在500 ml 水中加入溴化乙锭保存液, (-1ug/ml),混匀;
11)将疑胶轻轻滑入染色液,染色20-30分钟;
12)取出凝胶,用水稍漂洗;
13)紫外灯下确定DNA区带。
由于PCR能够使DNA分子大量扩增,所以应当注意防止反应体系被痕量DNA模板污染(Kwok和Higuchi,1989)。尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下,更有必要采取防备措施。
注意事项
1)在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自动移液器的管部是常见的污染源,配液和移液时应当使用一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。所有缓冲