文档介绍：基因工程药物研发的基本过程
基因工程药物的研发分为上游和下游两个阶段:
上游阶段:主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后,最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能,其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。
下游阶段:从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化,主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立,新型生物反应器的研制,高效分离介质及装置的开发,分离纯化的优化控制,高纯度产品的制备技术,生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造,电子计算机的优化控制等。
血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原
的一个酶解片段,相当于其1~4 Kringle 区,具有抑
制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿
瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑
制因子[1 , 2 ] ,对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消
化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研
究价值和应用前景.
PCR产物的T载体克隆
(一)        重组T质粒的构建
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有
5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底,可对载体进行5’除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自
环造成的高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。
1 材料
外源DNA片断
2 仪器、用具
移液枪、碎冰
3 试剂
pMD 18-T Vector;Ligation buffer;T4 ligatease;rATP
4 方法
连接体系如下:
16℃连接过夜。
(二)        重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定
1 材料
JM109菌株
2 仪器、用具
超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器
3 试剂
(1) CaCl2、LB平板(见附录);SOC培养基(见附录);SOB培养基
(2) RNase A1;Buffer S1;Buffer S2;Buffer S3;Buffer W1;无水乙醇的Buffer W2a
(3) 1×电泳缓冲液(TAE);溴化乙锭溶液(EB)[有毒,小心];琼脂糖;6×加样缓冲液
(4) 酚;氯仿;异戊醇
(5) ddH2O;10×PCR Buffer (Mg2+ plus);dNTP;M13+;M13-;TaKaRa rTaq酶
4 方法
1. 大肠杆菌感受态细胞的制备
(1) 取大肠杆菌JM109保存液50μl,接种于4ml LB(或SOB)液体培养基中,
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