文档介绍：第四节逆转录与RT-PCR Reverse transcription & RT-PCR
12/7/2017
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一、逆转录和逆转录酶的发现
实验现象:
1、1964年,Temin等首次发现:DNA合成抑制剂可以遏制鸟类肉瘤病毒ASV等RNA肿瘤病毒所造成的感染
表明在RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中需要合成 DNA。
2、ASV子代病毒颗粒的产生被放线菌素D所抑制
说明转录对于RNA肿瘤病毒增殖可能是必须的。
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假想:
DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌过程中的中间物
这一过程大致为:RNA肿瘤病毒-DNA原病毒(或前病毒)-RNA肿瘤病毒。
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证明:
1970年,Temin和Baltimore分别在RNA肿瘤病毒中发现了逆转录酶
(reverse transcriptase )。
Howard Temin and David Baltimore于1975年荣获诺贝尔生理与医学奖。
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二、逆转录病毒(retrovirus)
1. 定义:含逆转录酶的RNA病毒称为逆转录病毒。
所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒,但是,并不是所有的逆转录病毒都致癌。
2. 逆转录病毒的基因组:
逆转录病毒基因组由两条相同的正链RNA分子组成,每个约8,500nt,其5‘端有cap,3’端有ployA尾。
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三、逆转录酶(reverse transcriptase)
定义: 是RNA指导的DNA聚合酶。
具有三种酶活性,即RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶和RNase H的活性。
合成DNA的方向:
逆转录酶合成DNA的方向为5’-3’。
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合成DNA的引物:
不能从头合成DNA。引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的tRNA分子。
一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp为引物,而鼠类逆转录病毒则以宿主细胞tRNAPro为引物。
RNase H活性:是指逆转录酶可以从5’-3’和3’-5’两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。
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四、逆转录
1. 逆转录(reverse transcription): 是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。
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2. 逆转录病毒基因组复制过程
在逆转录过程中,新合成的DNA链要发生两次“跳跃”(jump),以改变链间碱基配对的位置,使双链DNA的两端产生相同的长末端重复序列LTR (long terminal repeats)。
LTR中含有整合信号、转录信号(启动子)、增强子和poly A位点等序列,通常只有左侧LTR中的启动子和右侧LTR中的polyA位点发挥正常功能,这是由它们所在的位置所决定的。
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