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鉏萍1，饶铃2，张晓鸣1作者介绍：鉏萍（1986- ），女，硕士硕士，食品化学
通信联系人：张晓鸣（1965- ），男，专家，博士，食品化学. E-mail:
Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu;China Haisheng Juice Holdings Co.,Ltd, Xian 710061, Shanxi;State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122;陕西海升果业发展股份有限公司，陕西 西安 710061;江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 2**********;;214122;;;;江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学涓苑83-320室;;江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学食品学院;;鉏萍（1986- ），女，硕士硕士，食品化学;;张晓鸣（1965- ），男，专家，博士，食品化学鉏萍;饶铃;张晓鸣CHU Ping;RAO Ling;ZHANG *|*期刊*|*尧渝，江和源，袁新跃. 茶多酚的提取制备技术[J]. 中国茶叶，(2) ：11–13.<CR>2*|*期刊*|*Cheng T O. All teas are not created equal The Chinese green tea and cardiovascular health[J]. International Journal of Cardiology (108) ：301–308<CR>3*|*期刊*|*Ananingsih V. K., Sharma A., Zhou W B. Green tea catechins during food processing and storage：A review on stability and detection[J]. Food Research International, ：1-11<CR>4*|*期刊*|*Bazinet L., Farias M. A., Doyen A., et al. Effect of process unit operations and long-term storage on catechin contents in EGCG-enriched tea drink[J]. Food Research International, （43）：1692−1701.<CR>5*|*期刊*|*宁静，李健权，朱旗等. β-CD微胶囊技术在茶饮料生产中的应用[J].生产技术，（3）：40-42.<CR>6*|*期刊*|*梅丛笑，方元超，赵晋府. 提高绿茶饮料风味的途径[J]. 饮料工业，，3（3）：4-8.<CR>7*|*期刊*|*梁靖，须海荣，陈利燕. β-CD在绿茶饮料加工中的保香作用研究[J]. 中国茶叶，（4）：18-19.<CR>8*|*期刊*|*林朝赐，张文文，阳春等. β-CD对液体茶饮料品质影响的实验研究[J]. 茶叶科学技术，（4）：4-8.<CR>9*|*期刊*|*廖开珠，陈宏坤. 几个惯用食品添加剂在绿茶饮料中的应用研究[J]. 综述与述评，，12（12）：6-9.<CR>10*|*专著*|*方元超，赵晋府. 茶饮料生产技术[M]. 北京：中国科学技术出版社，.<CR>11*|*期刊*|*different degrees of fermentation by SPME-GC analysis of the characteristic volatile flavour compounds [J]. Food Chemistry, (109): 196-206.<CR>12*|*期刊*|*Oh H. I., Hoff J. E., Armstrong S., et al. Hydrophobic interaction in tannin-protein complexes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1980, 28: 394-398.<CR>13*|*期刊*|*Siebert K. J., Lynn P. Y. Haze-active protein and polyphenols in apple juice assessed by turbidimetry[J]. Journal of Food Science, 1997, 62(1): 79-84.<CR>14*|*期刊*|*欧阳玉祝，石爱华，陈小东. 茶多酚-β-环糊精包络物抗氧化性研究[J]. 食品与发酵工业，, 33(8) ：52-54.<CR>15*|*学位论文*|*杨意成. 绿茶饮料苦涩味控制技术研究[D]. 杭州：浙江大学，.<CR>16*|*期刊*|*Kim E. S., Liang Y R, Jin J, et al. Impact of heating on chemical compositions of green tea liquor[J]. Food Chemistry, (103) ：1263−1267.<CR>17*|*期刊*|*Chen Z. Y., Zhu Q. Y., Tsang D., et al. Degradation of green tea catechins in tea drinks[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, (49)：477−482.|1|鉏萍|CHU Ping|江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122|State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu|鉏萍（1986- ），女，硕士硕士，食品化学|江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学涓苑83-320室|214122|||<CR>|2|饶铃|RAO Ling|陕西海升果业发展股份有限公司，陕西 西安 710061|China Haisheng Juice Holdings Co.,Ltd, Xian 710061, Shanxi||||||<CR>*|3|张晓鸣|ZHANG Xiaoming|江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122|State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu|张晓鸣（1965- ），男，专家，博士，食品化学|江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学食品学院|214122|||β-环糊精应用对绿茶饮料品质及贮藏稳定性影响的研究|Quality and storage stability studies of β-CD application in green tea beverage|
（1. 江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；
2. 陕西海升果业发展股份有限公司，陕西 西安 710061）
摘要：以茶多酚、蛋白质含量及感官评定为重要指标，考察β-CD对绿茶浸提及贮藏过程中品质的影响，通过HPLC测定儿茶素（EGC、EC、EGCG、ECG）及咖啡碱的含量，拟定了β-%。通过SPME-GC/MS对茶汤的挥发性物质进行分析，% β-CD能有效减少挥发性成分的挥发，掩盖不良气味。贮藏实验成果表明，β-CD能有效减少储藏期间茶汤中儿茶素EGCG的损失，储藏8周后，其茶汤中的EGCG含量是未添加的2倍，而对其它儿茶素及咖啡碱的影响不大。
核心词：β-CD；绿茶饮料；儿茶素；EGCG；香气；贮藏
中图分类号：
Quality and storage stability studies of β-CD application in green tea beverage
CHU Ping1, RAO Ling2, ZHANG Xiaoming1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu;
2. China Haisheng Juice Holdings Co.,Ltd, Xian 710061, Shanxi)
Abstract: The effects of supplement of β-cyclodextrin (β-CD) were investigated during the extraction and storage procedures of green tea. Tea polyphenols, proteins content and sensory evaluation were referred as the main indicators and HPLC, SPME-GC/MS was used for characterisation of catechins ((-)-Epigallocatechin EGC, (-)-Epicatechin EC, (-)-Epigallocatechin gallate EGCG, (-)-Epicatechin gallate ECG), caffeine and volatile components. Under these conditions, the addition of β-CD at a concentration of % was preferred and resulted in an effective reduction of evaporation of volatile components, with an effective benefit of eliminating bad odor. The storage stability study demonstrated an attenuated loss of EGCG in the green tea supplemented with β–CD. Of note, % β–CD exerted one-fold higher retention of EGCG in comparison of non β–CD treated group after 8 weeks storage, with little effects towards other catechins and caffeine.
Key words: β-CD; green tea beverage; catechins; EGCG; aroma; storage
引言
近年来， 瓶装或罐装的绿茶饮料因其天然健康、方便快捷、对人体有益等优点而受到广大消费者的青睐。茶多酚（teapolyphenol, TP）是茶叶中重要生理活性物质，其含有极强的去除有害自由基，制止脂质过氧化的作用[1]。其中儿茶素是茶多酚的重要成分，占多酚类总量的70%-80%，儿茶素有助于克制心血管疾病，尚有解毒和抗癌防辐射的功效[1,2]。然而在茶饮料热解决（浸提和杀菌）加工过程中，茶多酚中功效因子儿茶素的破坏很大[3]，在运输和储藏过程中儿茶素含量亦会大大减少。因此，市售即饮茶饮料中儿茶素含量都较低，其保健功效被大大削弱
[4]。如何提高茶饮料的儿茶素含量成为研究热点之一。
β-环糊精（beta-Cyclodextrin, β-CD）由7个葡萄糖单体构成，形成有一定容量空腔且比较结实的环糊精分子构造。分子外缘重要分布亲水的羟基，分子内部空腔有很高的电子密度和疏水性。这种外亲水内疏水的构造决定了β-CD含有分子微胶囊的性质[5]。根据其特性，通过混合或包埋技术将它添加到绿茶饮料加工中，可减少绿茶饮料在浸提、灭菌和贮藏中功效性成分的损失，对绿茶饮料的风味也起到较好的保护作用[6,7]。β-CD在食品工业中被广泛应用，在茶饮料中的应用也有有关报道[5,8,9]。然而，保持普通茶饮料中EGCG（表没食子儿茶素表没食子酸酯）和其它儿茶素的稳定性始终是一难题[4]，有关β-CD在浸提和贮藏期间对绿茶儿茶素稳定性影响的研究甚少。本研究旨在通过添加β-CD提高纯绿茶饮料的品质，拟定其最合用量，并研究其对茶汤质量和贮藏期间儿茶素及咖啡碱稳定性的影响。
材料与办法
重要材料，试剂和仪器
绿茶原料（袋装龙井，钱塘产区，杭州狮峰茶叶有限公司）；CAF（咖啡碱）、EC（表儿茶素）、EGC（表没食子儿茶素）、ECG（表儿茶素没食子酸酯）、EGCG（表没食子儿茶素表没食子酸酯）：上海融禾医药科技发展有限公司；β- 环糊精；水合茚三酮、SnCl2、95%乙醇、C16H4O6KNa·4H2O、H2SO4、HNO3、HClO4、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白：国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯试剂。
UV-1600紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；超声波细胞粉碎机(宁波海曙科生超声设备有限公司)安捷伦液相色谱仪1100； SPME 手动进样手柄（美国 Supelco公司）；微量进样器（上海医用激光仪器厂）；75 μm CAR/PDMS萃取头（美国 Supelco公司）；Trace MS 气相色谱质谱联用仪（美国Finnigan质谱公司）。
实验办法
茶汤的制备
将同季同批次茶叶粉碎并通过40-60目筛。 g置于100 mL新煮沸去离子水中，加入适量β-CD，超声波辅助浸提：根据前期实验成果选择浸提条件为功率90 W水浴50℃浸提20 min，采用脱脂棉过滤，冷却后离心15 min（3000 r/min）。储藏实验采用UHT杀菌（135℃，5 s），25℃恒温箱储藏。
茶多酚含量测定
茶汤中茶多酚含量运用酒石酸亚铁显色法[10]在540 nm测定吸光度，运用下式计算：
TP (mg/100 mL) =A××2×100。
蛋白质含量测定
茶汤中蛋白质含量运用考马斯亮蓝G-250法测定[10]，运用牛血清白蛋白作原则曲线：PRO(mg/100 mL) = ×A – (R2 = )。
儿茶素与咖啡碱含量测定
色谱条件：仪器：Waters 1525；色谱柱：Atlantis dc18（ × 150 mm, 5 μm）；%三氟乙酸（v/v）的水溶液，%三氟乙酸（v/v）的乙腈溶液，检测波长280 nm，柱温
30 ℃； mL/min，梯度洗脱。
表1 梯度洗脱程序表
Table 1 The program of gradient elution
时间（min）
0
5
8
11
13
16
A
90
84
84
75
90
90
B
10
16
16
25
10
10
min
EGC
ECG
CAF
EC
EGCG
图1绿茶茶汤样品的HPLC图谱
Figure 1. The HPLC chromatogram for major catechins in green tea beverage
茶汤感官评定
感官评定小组由8位经训练的人员构成，以汤色(颜色、亮度) 、茶香气、滋味(茶味、苦味)5个方面作为评定指标。
评定办法按5分制()，颜色：黄绿()→棕褐()；亮度：明亮()→暗沉()；茶香气：纯正()→异味()；苦味：很苦()→无()；茶味：浓郁()→无()。
茶汤香气成分测定
茶汤风味中多个香气成分采用SPME-GC/MS法进行定性分析，其中定量分析采用香气成分峰面积与内标(邻二氯苯)峰面积之比计算。
固相微萃取(SPME)条件： g的茶汤， μl邻二氯苯溶液[11]( mg/ml),采用SPME萃取30 min (50 ℃)。
气相色谱条件： 色谱毛细管柱PEG0柱(柱长60 m， mm，液膜厚度1 μm)；起始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的升温速率升温到80 ℃，然后以10 ℃/min的升温速率升温到230 ℃，保持8 min；汽化室温度250 ℃；载气为He， ml/min；分流比为20:1。
质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，灯丝发射电流150 μA，离子源温度200 ℃，接口温度为250 ℃，扫描质量范畴33-450 m/z。
统计分析
数据统计分析采用GraphPad Prism （GraphPad Software, La Jolla, California），成果以平均值±原则差（Mean±SE）表达。同组内两值间比较采用T检查，组内单因素/双因素比较采用单/双因素变异数分析（One/Two-way ANOVA）。。*P < , **P < , ***P < 。
成果与讨论
β-CD添加量的拟定
不同β-CD浓度对茶汤中茶多酚及蛋白质含量的影响
图2 β-CD的不同添加量对茶汤中茶多酚及蛋白质含量的影响
Figure 2. The effect of β-CD dosage on content of tea polyphenols and protein
如图2所示，由于β-CD对茶多酚的包埋减少了茶多酚在浸提过程中的氧化，因而随着β-CD添加量的增加，茶汤内茶多酚的含量逐步增加。当β-CD的添加量＞%时，β-%后来逐步饱和，因此茶多酚的增加随β-CD的添加量增加趋于平缓。
由于考马斯亮蓝的染色原理是与蛋白质的疏水基团络合变成青色，而β-CD的疏水空腔能够与蛋白质的疏水构造相结合，因此采用考马斯亮蓝法测定茶汤中的蛋白质，体现为随着β-CD添加量的增加蛋白质含量下降（图2）。同时，茶乳酪的重要成分为茶多酚、咖啡碱及蛋白质以及多个碳水化合物，这些物质通过氢键以及疏水作用力相结合产生茶乳酪，其它大量的碳水化合物，虽没有参加到茶乳酪的形成机制中，但亦可单纯吸附于茶多酚和蛋白质的聚合物中[12,13]。因此，通过β-CD对茶多酚及蛋白质的包埋作用可有效减少茶乳酪的产生。
不同β-CD浓度对茶汤中儿茶素及咖啡碱含量的影响
注： EGCG: *P < %组；ECG：#P < %组
图3 β-CD的不同添加量对茶汤中儿茶素及咖啡碱含量的影响
Figure 3. The effect of β-CD dosage on content of catechins and caffeine.
由图3可知：当β-CD添加量≥%，与未添加组相比EGCG的含量明显提高，当β-CD添加量≥%，与未添加组相比EGC的含量明显提高，在超声波浸提的时候添加β-CD对儿茶素进行包埋，能够避免浸提过程中溶出儿茶素本身的氧化聚集，同时也能够制止超声对儿茶素的破坏[14]。由于采用的是超声辅助浸提，温度为50℃，时间20 min，温度低时间较短，儿茶素的氧化聚集较少，茶乳酪尚未生成，因此在浸提过程中，对于EC、ECG和CAF，β--%范畴内对其影响不大。
感官评定
绿茶茶汤的汤色以黄绿明亮、不浑浊、不沉淀为佳；茶汤香气以靠近原料茶的香气品质为佳；茶汤滋味以含有原料茶应有的滋味，无熟汤味、异味者为佳，茶味淡薄，有熟汤味者为次[10]。加入β-CD能够包合茶汤中的叶绿素，同时能够避免儿茶素的氧化褐变，对绿茶茶汤色泽有主动作用。在绿茶饮料加工中，可运用β-CD的包络作用，避免香气的挥发和损失，达成保香增香的目的[7]。实验制备的茶汤，其茶多酚、儿茶素和咖啡碱含量都较高。普通认为引发绿茶苦味的重要物质是生物碱和多酚类物质，另首先是少量的氨基酸[15]。茶多酚对绿茶饮料滋味的影响较为复杂，首先能够提供绿茶特有的收敛味，决定茶汤的浓度，另首先，它是形成苦涩味的重要物质，当其浓度过大时对滋味品质带来消极的影响。采用适量的β-CD对其包埋封闭解决，可减少其对味觉神经的刺激，减少茶汤的苦涩味。
表2 感官评定成果
Table 2. The results of sensory evaluation
序号
茶汤中 β-CD%
汤色
茶香气
滋味
颜色
亮度
苦味
茶味
1
0
a±
a±
a±
d±
a±
2
ab±
a±
a±
c±
ab±
3
bc±
ab±
a±
c±
bc±
4
bc±
ab±
a±
c±
c±
5
bc±
ab±
b±
b±
c±
6
bc±
b±
b±
a±
d±
7
c±
c±
c±
a±
e±
a-e 同列中数据的不同上标字母代表有明显差别(P < )
由表2可知：随着β-CD添加量的增加，其茶汤的香气和茶味递减，但原料茶中原有的烟焦气味及苦涩味明显消失；茶汤色泽随β-CD加入量的增大而缓慢变浅，亮度也变暗；添加β-%左右最为适宜，过少则无法起作用，过多则使绿茶茶香茶味过淡。
β-CD对绿茶茶汤挥发性成分的影响
为了进一步研究β-CD对于绿茶样品香气形成的影响，采用SPME/GC-％β-CD的两种样品中的挥发性成分进行分析鉴定。GC图以下(图4)，能够发现，添加β-CD后，最后茶汤的挥发性成分种类和比例基本无变化，但其含量明显减少。这阐明β-CD对茶汤的中的风味物质只起包埋作用，对茶汤中的挥发性成分有缓释效果，不会引发茶汤主体香气的不良变化。
（a）
（b）
图4 样品的GC图：（a）未添加β-CD；（b）%β-CD
Figure 4. The GC chromatogram for volatile components in the absence (a) and presence (b) of % β-CD in green tea beverage.
表3茶汤中挥发性风味物质含量
Table 3. The content of volatile component in green tea beverage
类型
名称
含量（μg/Kg）
未添加β-CD
%β-CD
醇
1-戊烯-3-醇
-
4-乙炔基-4-甲基-1,5-己二烯-3-醇
戊醇
2-戊烯-1-醇
1-辛烯-3醇
1,6-辛二烯-3-醇
辛醇
脱氢芳樟醇
β-松油醇
十二烷醇
柏木醇
-
十一醇
小计
醛
己醛
辛醛
壬醛
2,4-庚二烯醛
苯甲醛
-
β-环柠檬醛
2-葵烯醛
-
2-十一烯醛
小计
酮
甲基庚烯酮
3,5-辛二烯-2-酮
香叶基丙酮
α-紫罗酮
-
β-紫罗酮
4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮
小计
酯
邻苯二甲酸二乙酯
邻苯二甲酸二异丁酯
小计
累计
由于β-CD含有环状中空筒形的特殊构造，能将大小适合的疏水性物质的分子或基团嵌入其中形成包合物，从而避免挥发性成分的挥发，掩盖不良气味，减少刺激性[7]。从表3可见，添加β-CD后，醇类、醛类、酮类、酯类中大部分挥发性成分都明显下降。醇类中的烯醇含量过高容易造成茶饮料出现不良气味，产生陈茶味，添加β-CD后除1-戊烯-3-醇外，其它四种烯醇含量都有明显减少。醛类普通含有刺激性气味，通过添加β- μg/Kg，减少了茶汤的刺激性，使得茶香更为纯正。茶汤中的香气成分对热十分敏感，在经历杀菌工序后变化较大，茶叶香气之间的平衡被破坏，普通都远逊于原茶的香气品质，有闷熟气味甚至不良气味产生
[6,7]。绿茶饮料香气的变化重要是由于某些香气的前驱物质转变，如带羟基的醇类物质的变化，因而β-CD对茶汤中挥发性物质的包埋，在保护有益的香气成分的同时，也能够避免其在杀菌过程中气味的恶变。
贮藏稳定性研究
茶汤中茶多酚及蛋白质含量变化
图5 β-CD对茶汤中茶多酚及蛋白质储藏稳定性影响：(a)茶多酚；(b)蛋白质
Figure 5. The effect of β-CD on storage stability of tea polyphenols (a) and protein (b) in green tea beverage
由图5可见，茶饮料中的茶多酚和蛋白质含量均随着贮藏时间的增加而下降。贮藏实验中，%β-CD组茶汤中茶多酚含量明显高于未添加组；蛋白质含量明显低于未添加组。同时，茶汤中的蛋白质含量呈现先下降后升高的趋势，这可能是由于开始阶段茶汤中的蛋白质与多酚相结合，而在贮藏后期，多酚与蛋白质间的键合作用被打断，蛋白质释放出来，使得蛋白质含量增高。
茶汤中儿茶素及咖啡碱含量变化
图6 β-CD对茶汤中儿茶素及咖啡碱贮藏稳定性的影响: (a) EGC；(b) EC；(c) EGCG；(d) ECG；(e) CAF
Figure 6. The ef