文档介绍：第四章目的基因的制备
一、目的基因的概念
二、获得目的基因的方法
三、目的基因用途
2017/12/15
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一、目的基因的概念
外源基因:插入到载体上并导入到宿主细胞内的特定基因或DN***段,称为外源基因。
目的基因:通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DN***段,称为目的基因。
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目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因,诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。随着生物长期的进化,生物界积累了大量对人类有用的基因。它是大自然恩赐于人类的宝贵资源,等待人们去开发利用。
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二、获得目的基因的方法
直接分离法
逆转录法
聚合酶链式反应法(PCR法)
鸟枪法
人工化学合成法
基因文库法(基因组文库、cDNA文库)
mRNA差异显示法
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㈠鸟枪法
鸟枪法:是将基因组按染色体分开后,将它全部打乱,切成碎片,进行随机测序,测序后再将它们拼接起来,进而获得目的基因的方法。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。
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鸟枪法的优点:
速度快,简单易行,成本较低,并能获得与天然基因组DNA一亲的有内含子的基因DN***段。
鸟枪法克隆目的基因的缺点
补平基因缺口困难
排序拼装麻烦,工作量较大
专一性较差
需要了解目的基因的背景知识
不能获得的最小长度的目的基因
不能除去真核生物目的基因的内含子结构
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鸟枪法制备目的基因的主要步骤
①染色体DNA的切断
超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端
全酶切: 片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控
部分酶切: 片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整
②DN***段与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体
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③重组DNA分子导入受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞
④筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)
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㈡直接分离法
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⑴限制性核酸内切酶酶切分离法:
①对已定序的DNA分子,只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割,分离纯化所需DN***段,与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。
②对已知定位的目的基因,只要根据目的基因两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位点,用适当的限制性核酸内切酶切割,一次就可获得目的基因。
③即使含目的基因的DNA分子未定序或无定位,也只须先通过酶切分析, 随后再通过部分酶切, 克隆构建一个非常简单的基因组文库,从中钓出目的基因。
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