文档介绍：分子克隆
分子克隆概述
Clone (克隆)的含义
Clone 最早指无性繁殖系,现在有了许多新的含义。
作为名词的“克隆”
。
。最为常用的是描述微生物的一个菌落。这些微生物带有插入特定DN***段的载体分子。
作为动词是“去克隆”
即利用体外重组技术将一个特定的基因或DNA插入一个载体分子的过程,有时也包含将此重组子转入宿主菌。
分子克隆的一般程序
分子克隆的一般程序
1、  目的基因的获得和加工
2、  载体的选择和加工
3、  载体和目的基因的连接
4、  感受态细胞的制备
5、  重组子导入宿主细胞
6、  阳性克隆的筛选和鉴别
7、  外源基因表达的检测
载体
基因组DNA
剪切
末端处理
剪切
重组
转化
E. coli
分子克隆流程示意图
目的基因的获得
生物学方法
PCR
基因文库筛选
图谱法
转座子标签法
逆转录
差异显示
化学合成方法
根据序列用化学方法来合成
目的基因的加工
目的DN***段在进行重组前经常需要加工以满足:
连接的需要
偏爱密码子的需要
定点突变的需要
目的基因的加工
1、加接头形成粘性末端。
2、通过PCR等方法引入定点突变。
3、通过PCR等方法使密码子适应宿主的偏爱性。
4、***化消除一些酶切位点。
5、去磷酸化减少自连。
6、末端转移酶催化产生同聚尾。
7、末端补平。
载体的选择
选择载体时应考虑以下几个问题:
1、目的片段的大小。
2、宿主的差异。
3、是否需要表达。
4、是否需要组织特异性表达或诱导表达。
5、宿主对抗性标记的敏感程度。
载体的加工
在将载体和目的DN***段连接之前,一方面要对目的片段进行加工,另一方面也要对载体进行适当的加工使其满足高效连接的需要。在没有合适的载体时,需要对通用载体进行改造使其满足实验的需要。
载体的加工方法
1、  限制性酶切产生粘性末端。
2、  去磷酸化减少载体自连。
3、  加入特殊的启动子,改造成特异表达载体。
4、  末端转移酶催化产生同聚尾。
5、末端补平。