文档介绍：分子克隆
中南大学生物医学工程所郭灿
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(一).基本概念
(二).分子克隆技术的基本过程
(三)分子克隆实验常见问题解答
主要内容
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(一)基本概念:
克隆(Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆(Molecular Cloning) 是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组,将重组分子导入到合适的受体细胞中,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得DNA分子大量复制,并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。
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载体DNA
(vector)
目的DNA
(target fragment)
重组DNA
(binant DNA )
宿主(host)
筛选、扩增
克隆(clone)
分子克隆的路线
DNA 重组
转化
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分子克隆的基本过程
分—获取目的基因和载体
接—目的基因与载体的连接
筛—重组DNA的筛选与鉴定
转—重组DNA导入宿主细胞
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目的基因的来源
Contents
Contents
聚合酶链反应
制备基因组DNA
制备cDNA
人工合成基因
.
目的基因来源
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目的基因与载体的连接
粘性末端连接
平头末端连接
人工接头法
同源多聚尾连接法
将目的基因和载体用同一种限制酶酶切,产生相同粘性末端,再通过DNA连接酶作用将两者连接起来,构成重组DNA分子
有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端,此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连起来。
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接,构建重组DNA。
要求DNA分子内部必须完整,即两个DNA链间不存在缺口;否则末端脱氧核苷酸转移酶也会在3’-OH上加入多聚尾巴,破坏了DNA分子活性
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重组DNA导入宿主细胞的类型
转化:以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程
转染:以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程
转导:以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程
类型
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重组DNA的筛选与鉴定
平板筛选(插入失活、蓝白筛选)
限制酶切图谱筛选
PCR筛选重组体
原位杂交技术
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2
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重组DNA的筛选与鉴定方法
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:
(1). 使核酸降解的核酸酶类:
核酸内切酶、核酸外切酶。
(2).催化核酸合成的酶类:
DNA聚合酶,RNA聚合酶,连接酶,逆转录酶。
(3). 核酸修饰酶类;
***化酶,激酶,基团转移酶, 磷酸酶等。
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