文档介绍：分子克隆技术实验操作手册 2005 生命科学技术学院 1 课程简介分子克隆技术是指 DNA 的无性繁殖技术。分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧,主要包括分子克隆和分子杂交两大部分: 分子克隆技术: DNA 重组技术是分子生物学的核心内容。本实验利用质粒载体克隆外源 DNA 片段,通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源 DNA 的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。分子杂交技术: 实验室常用的分子杂交技术主要有 Southern blotting , Northern blotting ,Western blotting 及Dotblotting 等。 Southern blottin g 是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的 DNA ,经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段,随后 DNA 在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上(***纤维素膜或尼龙膜)。DNA 转移至固相支持物的过程中各 DNA 的相对位置保持不变,用一定方法( 如放射性同位素) 标记的 DNA 探针与固着在膜上的 DNA 杂交,经X-光片自显影显现出与探针 DNA 互补的 DNA 电泳条带的位置,然后进行分析。本实验要求掌握植物总 DNA 的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、 DNA 的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。为让学生初步了解有关 RNA 的操作过程注意事项,我们还列出 Northern blotting 的操作步骤以供选择。 2 目录系列一分子克隆技术....................................................................................................... 4 实验一质粒的制备........................................................................................................ 4 实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳......................................................................... 5 实验三外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆........................................... 7 实验四感受态细胞的制备....................................................................................... 9 CaCl2 感受态细胞的制备实验步骤........................................................................................ 9 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤................................................................. 10 实验五质粒的转化及转化子的鉴定.............................................................. 11 热激法转化实验步骤: .......................................................................................................... 11 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤.......................................................................... 12 实验六 PCR 技术........................................................................................................... 12 系列二 Southern 杂交技术....................................................................................... 14 实验一植物总 DNA 的快速少量抽