文档介绍：实验四 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
原理----电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
不用支持物的
利用支持物
1）纸电泳
2) 淀粉凝胶电泳
3实验四 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
原理----电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
不用支持物的
利用支持物
1）纸电泳
2) 淀粉凝胶电泳
3) 琼脂糖凝胶电泳
4）醋酸纤维薄膜电泳
5）聚丙烯酰***凝胶电泳（PAGE）
泳动度U
泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度
U=v/E=dl/Vt
E:电场强度，每cm的电压降，V/l
v:颗粒的移动速度，d/t
d:颗粒的移动距离
t:通电时间
V:加在支持物两端的实际电压
l:支持物的有效长度
影响泳动速度的主要因素
1）电场强度：（越大，移动速度越快）
常压电泳：100-500V，2-10V/cm
高压电泳：500-10000V， 20-200V/cm
2）溶液的pH值：buffer。
3）溶液的离子强度： （I越大，速度越慢；缓冲
效果越好） ，-。
4）电渗现象：液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。
尽量避免有高电渗作用的支持物。
聚丙烯酰***凝胶电泳（PAGE）
Davis 和Ornstein 1959年---人血清蛋白
聚丙烯酰***凝胶：丙烯酰***（Acr，单体）和N,N′-甲叉双丙烯酰***（Bis，交联剂）共聚合而成（由过硫酸铵-四乙基乙二***TEMED系统或核黄素-TEMED系统激发）。
分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制孔径大小，达到不同的分离目的。
凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）
SDS：十二烷基硫酸钠CH3（CH2）11OSO3Na，阴离子去污剂，与蛋白质结合，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，破坏蛋白质的二级、三级、四级结构。
1）先加还原剂如巯基乙醇打开-S-S-；
2）SDS破坏蛋白质构象，与氨基酸侧链充分结合，形成蛋白质亚基-SDS胶束。SDS是阴离子，使多肽链带上负电荷，该电荷量远远超过蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质之间的电荷差别。电泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰***凝胶电泳
作 用
使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质-SDS胶束，消除蛋白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，，长轴正比于蛋白质分子量。
MW在15200kDa，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。
logM=a-bRf，Rf为迁移率
操作-准备
l．醋酸纤维薄膜(CAM)的准备：薄膜放进缓冲液中，自然浸润，约20分钟。
2．电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边缓冲液高度一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖.
3．点样：将充分浸透(指膜上无白色斑痕)的薄膜取出，用滤纸轻轻吸去膜上过多缓冲液，粗糙面(无光泽面)用于点样，载玻片蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。
操作-----电泳
4．加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端。薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电。
5．连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V。电泳50分钟，断电。
6．染色：用镊子取出薄膜条投入染液8分钟，染色期间轻轻晃动染色皿，使染色充分。
7. 漂洗 :从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。
实验报告
将薄膜条粘贴于实验报告，并标明各带所代表的蛋白质，完成实验报告。
(本实验结束后，电泳槽内的缓冲液不要倒掉；染色液需要回收，漂洗液请倒入废水缸)。
本周值日:第四组
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