文档介绍：基因表达差异分析方法进展
关键词: 基因 表达 差异 
高等真核生物的基因组一般具有80 000侵~100 000个基因,而每一个细胞C大约只表达其中的15%[1]。基因在蟋不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达杳决定了生命活动的多样性,如发育与分化纤、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调镘控等。比较细胞间基因表达的差异为我们晋揭示生命活动的规律提供了依据。
由于︿真核细胞 mRNA 3′端一般含有 poly尾,因此现有的方法基本上都是利用共同引物将不同的 mRNA反转录成 cDNA,以 cDNA为对象研究惜基因表达的差异。1992年 Lian容g等[2]建立了一种差异显示反转录 圃pCR法,为检测成批基因表达的差异开0辟了新天地。迄今为止已出现了大量应用抽该技术的研究报道[3,4]。然而,尽撵管应用 dDRT-PCR方法已经取得窦了不少成果,而且该方法还在不断改进之筢中,但它仍然存在几个难以解决的问题:匐(1)重复率低,至少有20%的差异条蠕带不能被准确重复[5];(2)假阳性、率可以高达90%[6];(3)获得的境差异表达序列极少包含编码信息。近年来喷,针对 dDRT-PCR方法的不足,又有几种新的检测差异表达基因的方法出J现,现仅就这方面的进展做一简要介绍。
: gEF技术使用生掊物素标记的引物 bio-T13合成 廖cDNA第一链,用 dGTP对其进行颇末端加尾,再以富含 c的引物引发合成刂 cDNA第二链。用限制性内切酶消化窆双链 cDNA,以交联有抗生物素蛋白艹的微球捕获 cDNA3′端,以 t4哇DNA连接酶连接同前述内切酶相对应的伪适配子,并以 bio-T13及适配子鸩中的序列作为新的引物进行特异的 pC刿R扩增,得到大量的特异 cDN***段胆。适配子末端被32P-dATP标记后制,固定于微球上的 cDN***段经过一途系列酶切,产生的酶切片段从微球表面释⒒放出来,其中那些含有标记末端的片段经伧凝胶电泳后构成 mRNA指纹图谱。通洮过分析不同细胞间的指纹图谱就能得到差勖异表达的序列[7]。 gEF技术所需蹁的工作量较 dDRT-PCR明显减少璁,由于用酶切反应替代了条件不严格的 气pCR反应,其重复性也较好,假阳性率形低,并且所获得的片段中包含有一定的编码信息。 gEF技术最大的缺点在于电哨泳技术的局限。由于它的指纹图谱要显示扼在同一块电泳胶上,经过几轮酶切之后常酎会得到1 000~2 000条电泳带竦,而现有的 pAGE电泳很少能分辨超过400条带,故只有15%~30%的黝 mRNA能够被辨认出来,因此得到的铈只能是高表达基因。如果希望寻找部分新秸基因,这是一种比较简单有效的方法;如堙果希望得到有关某种细胞的基因表达谱,梗可能比较困难;采用双向电泳技术可能会…有所帮助[8]。
: sAGE法的建立基于两条理论。倍首先,一段来自某个转录子确定位置的核挣苷酸,其长度只要有9~10个 bp,蠓就能够特异地确认该转录子。第二,对短肖片段标签的链接有利于在同一克隆中对多饯个标签测序。 sAGE也是用生物素标迁记的 bio-Oligo(dT)为引物合成双链 cDNA,然后以限制酶进喜行酶切,捕获 cDNA3′端。在此处遇产物被分为两部分,分别与包含有 iI罚S型内切酶位点的 a、 b连接子